ניתוח הישרדות תאי Purkinje בתרביות פרוסות צרבלריות אורגנוטיפיות

תקציר

מקור: Rakotomamonjy, J., et al. Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים טכניקה להשגת פרוסות אורגנוטיפיות של המוח הקטן ממוחו של גור עכבר וטיפוח הפרוסות במדיה בתוספת חומרים מזינים וגורמי גדילה כדי לחקות את התפתחות המוח הקטן במבחנה. בנוסף, פרוסות צרבלריות ספציפיות מטופלות בתרכובת בדיקה, ויכולת ההגנה העצבית של התרכובת מנותחת באמצעות טכניקת צביעה אימונופלואורסצנטית.

פרוטוקול

1. הכנה לפני תרביות פרוסות צרבלריות אורגנוטיפיות

1. במכסה מנוע של תרבית תאים שרוסס מראש באתנול 70%, הכינו 200 מ"ל של מדיום תרבית בפילטר ואקום של 250 מ"ל המחובר למקלט בקבוק סטרילי. הוסף 100 מ"ל של עיט בינוני בסיסי (BME), 50 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS), 50 מ"ל של נסיוב סוסים מומת חום, 1 מ"ל של 200 מ"ל L-גלוטמין (ריכוז סופי 1 מ"מ), ו 5 מ"ל של 200 גרם / ליטר גלוקוז (ריכוז סופי 5 מ"ג / מ"ל). סנן ואקום את מדיום התרבית ושמור אותו ב +4 ° C עד חודש.
2. בארון הבטיחות הביולוגית המעוקר, הוציאו צלחת תרבית בת 6 בארות מהאריזה. מלא כל באר עם 1 מ"ל של מדיום תרבות. אם נבדק טיפול, הוסף את החומר התרופתי לבאר המטופלת, ואת אותו נפח של תמיסת רכב לבאר הבקרה. במחקר הנוכחי הוספנו 1 μL של תמיסת KCl סטרילית 3 M לבאר המטופלת (30 מ"מ סופית) ו-1 מיקרוליטר מים סטריליים לבארות הבקרה.
3. הכניסו לתוך מכסה המנוע של תרבית התאים את המספר הדרוש של תוספות תרבית תאים עטופות בנפרד עם קרום פוליטטרה-פלואוראתילן הידרופילי (PTFE) (גודל נקבוביות = 0.4 מיקרומטר). בזהירות לפתוח אותם ולהוציא את תרבית התא תוספות עם מלקחיים סטריליים. זרקו אותם אחד אחד לבאר של צלחת 6 בארות, והימנעו מבועות בממשק שבין קרום ההחדרה למדיום תרבית התא. תן לתוספות לאזן בתווך ב 37 ° C, 5% CO₂ אינקובטור לפחות 2 שעות לפני תרבית.
   הערה: מסוק הרקמה שוכן דרך קבע במכסה המנוע של תרבית התא.
4. הכינו שתי כוסות של 200 מ"ל, אחת מלאה במים סטריליים של 150 מ"ל, והשנייה מלאה באתנול 70% של 150 מ"ל. טבלו את כלי הניתוח באמבט אתנול 70% ולאחר מכן במים לפני השימוש בהם.
   הערה: אין להשתמש בכלי ניתוח מיד לאחר מגע עם אתנול.
5. יש לחטא את להב הפיפיות בכד אתנול 70%. הניחו אותו על מחזיק הלהב באמצעות מלקחיים סטריליים והחזיקו אותו במקומו באמצעות מפתח מהדק הלהב. הניחו לו להתייבש עד לשימוש.
6. יש לחטא את דיסק הפלסטיק שסופק עם מסוק הרקמות במיכל אתנול 70%. רססו את שולחן החיתוך באתנול 70% לפני הנחת הדיסקית עליו. הניחו לייבוש עד לשימוש.

2. דיסקציה ותרבויות פרוסות אורגנוטיפיות של המוח הקטן

1. הביאו את גור העכבר לתוך מכסה המנוע של תרבית התאים כדי לבצע את הנתיחה.
2. ערפו את ראשו של הגור במהירות באמצעות מספריים ישרים (איור 1A).
3. תוך כדי החזקת ראשו של הגור ליד האף עם מלקחיים ישרים, יש לפתוח את הקרקפת באמצעות מספריים ישרים לעין, החל מהקצה האחורי, וללכת לרוחב לקו האמצע.
4. המשך באופן זהה עבור הגולגולת.
   הערה: הקפידו לכוון את קצות המספריים החוצה כדי למנוע פגיעה במוח הקטן במהלך הדיסקציה.
5. מוציאים את המוח ומעבירים אותו לצלחת 60 מ"מ מלאה HBSS קר + 5 מ"ג/מ"ל גלוקוז.
6. נתחו בזהירות את המוח הקטן באמצעות מלקחיים סטריליים ישרים ועדינים (איור 1B). העבירו אותו על דיסק הפלסטיק המונח על שולחן החיתוך של מסוק הרקמות באמצעות מלקחיים דקים מעוקלים סטריליים.
7. לכוון את הרקמה על ידי סיבוב שולחן חיתוך לבצע חתכים parasagittal.
8. הזז את שולחן החיתוך על ידי משיכת ידית שחרור השולחן ימינה, כך שהלהב ממוקם בקצה הרקמה.
9. כוונן את עובי הפרוסה ל-350 מיקרומטר ואת מהירות הלהב לבינונית.
10. הפעל את המסוק. לאחר שכל המוח הקטן נחתך (איור 1C), כבו את המסוק.
11. הסר את דיסק הפלסטיק עם מלקחיים סטריליים.
12. קרבו בזהירות את דיסק הפלסטיק לצלחת 60 מ"מ המכילה HBSS + 5 מ"ג/מ"ל גלוקוז. פיפטה HBSS קר + 5 מ"ג / מ"ל גלוקוז על הרקמה באמצעות פיפטת העברה סטרילית כדי לאפשר קצירת פרוסות המוח הקטן בצלחת מלאה חיץ.
13. להפריד את פרוסות המוח הקטן אחד מהשני באמצעות microprobe. הוציאו מקטעים באיכות טובה עם פיפטת ההעברה (מומלץ להשתמש במקטעי רקמה הקרובים לוורמיס) ושחררו אותם בתרבית תאים מאוזנת מראש (איור 1D).
14. מקם את פרוסות המוח הקטן על הכנס תרבית התא באמצעות microprobe, ולאחר מכן בזהירות להסיר את עודף HBSS + 5 מ"ג / מ"ל תמיסת גלוקוז עם פיפטה העברה.
    הערה: בשלב זה הרקמה רכה ביותר ומועדת לנזק פיזי. המספר המרבי של פרוסות המוח הקטן לכל תוספת תרבית תאים תלוי בגיל בעל החיים התורם. ניתן לגדל 6-8 פרוסות עבור חיה בת P0-P4, ו-4-6 פרוסות עבור בעלי חיים מעל P5.
15. מניחים את מנת התרבות באינקובטור, מחליפים את המדיום לחלוטין כל 2-3 ימים.
16. כדי להעריך את הישרדות תאי Purkinje, פרוסות ניתן לאסוף כבר 5 ימים במבחנה. למטרות אחרות, הם יכולים להישמר בתרבית במשך כמה שבועות (איור 1F).
    הערה: במקרה של ניסויי הישרדות של תאי Purkinje, אין צורך לחדש את הטיפול התרופתי בעת שינוי מדיום תרבית התאים (איור 1F).

3. אימונופלואורסנציה

1. מוציאים את צלחת 6 הקידוחים מהאינקובטור. מוציאים את מדיום תרבית התא, שוטפים את תרבית התאים עם 1x PBS, ומקבעים את הפרוסות בתמיסת פרפורמלדהיד 4% קרה למשך שעה אחת, עם 1 מ"ל מתחת לתוספת תרבית התא ו-500 מיקרוליטר מעל תוספת תרבית התא.
2. שטפו את התוספות 4x 10 דקות עם 1x PBS, עם 1 מ"ל מתחת ו 500 μL על גבי העלון, על שייקר מסלולי.
3. בעזרת מברשת, מעבירים את פרוסות המוח הקטן מתוספת תרבית תאים אחת לבאר אחת של באר 24 מלאה מראש ב-1x PBS, 0.25% Triton X-100 ו-3% BSA (PBS-TB), 500 μL/well.
4. חדרו וחסמו את הפרוסות על ידי דגירה ב-PBS-TB למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
5. דגירה עם נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת PBS-TB, למשך הלילה ב + 4 ° C, על שייקר מסלולי, 200 μL / באר.
6. למחרת, בצע ארבע שטיפות של 10 דקות עם 1x PBS, על שייקר מסלולי, 500 μL / באר.
7. דגירה עם נוגדנים משניים מדוללים בתמיסת PBS-TB, שעתיים בטמפרטורת החדר, על שייקר מסלולי, ומוגנים מפני אור, 200 μL/well.
8. בצע ארבע שטיפות של 10 דקות עם 1x PBS, על שייקר מסלולי, 500 μL / באר.
9. יש להכתים את הפרוסות באמצעות Hoechst 33342, מדוללות ב-1x PBS (2 מיקרוגרם/מ"ל), למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנות מפני אור, 500 מיקרוליטר/באר.
10. הר את פרוסות המוח הקטן על שקופית מיקרוסקופיה עם פיפטה העברה. תן להם להתייבש באוויר לחלוטין, מוגן מפני אור. לחלח אותם מחדש עם 1x PBS ולהחיל כיסוי מכוסה כמה טיפות של אמצעי הרכבה (~ 80 μL). הימנעו מיצירת בועות.
11. לאחר שמדיום ההרכבה נרפא, חלקים צרבלריים מוכנים לצילום.

4. הדמיה וכימות של הישרדות התא

1. הפעל את המיקרוסקופ והלייזרים בהתאם ליצרן.
2. הפעל את תוכנת הרכישה.
3. באמצעות מטרה של 10X, אתרו פרוסות צרבלריות ללא שינוי המציגות 9–10 אונות (בדרך כלל חתכים צרבלריים קרובים לוורמיס).
4. הפעל רכישת z-stack. הגדר את הטווח של ערימת z כך שתכלול את כל תאי Purkinje הנמצאים בפרוסה המוח הקטן. הגדר גודל צעד של 2 מיקרומטר והתחל את הרכישה. שמור את התמונה שנרכשה בתבנית של יצרן תוכנת הרכישה כדי לשמר את המטה-נתונים המשויכים.
5. פתח את הקובץ שנרכש ב- ImageJ באמצעות תוסף Bio-formats.
6. עבור אל Image > Stacks >- Z-project... (איור 2A).
7. בחרו 'עוצמה מרבית' בתפריט הנפתח 'סוג הקרנה' ולחצו על 'אשר' (איור 2B).
8. תיווצר תמונה דו-ממדית משוטחת. לחצו פעמיים על הכלי Multi-point כדי לאפשר לחלון הכלי Point להופיע. בטל את הסימון באפשרות נקודות תווית כדי להקל על התצוגה החזותית של תאים שנספרו. לאחר מכן, לחצו ישירות על סומא של תא Purkinje כדי להתחיל לספור (איור 1E). המספר הכולל של התאים שנספרו יצוין בתחתית החלון Point Tool (איור 3).
   הערה: בדרך כלל, ניתן לכמת לפחות 3 מקטעים שאינם פגומים המכילים 9-10 אונות לכל תוספת תרבית תא. כדי להעריך את ההשפעה neuroprotective של סוכן פרמקולוגי, לפחות 3 ניסויים עצמאיים צריך להתבצע.

תוצאות

איור 1: המחשה של הפרוטוקול מדיסקציה לכימות הישרדות תאי Purkinje. ראשו של גור העכבר נערף במהירות (A). לאחר דיסקציה מוחית, המוח הקטן מבודד (B), ולאחר מכן קצוץ לפרוסות ברוחב 350 מיקרומטר (C). חלקי המוח הקטן מונחים על גבי תוסף בקרה או תרבית תאים מטופלת (D) ונשמרים בתרבית לפחות 5 ימים במבחנה. לאחר מכן הרקמה קבועה ב -4% paraformaldehyde, i...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Alexa Fluor 594 חמור נגד עכבר IgG נוגדן משני	ThermoFisher מדעי	A21203
עיט בינוני בסיסי (BME)	ThermoFisher מדעי	21010046
ארון בטיחות ביולוגית Class II, סוג A2	נואיר	NU-540-400
אלבומין בסרום בקר	מיליפור סיגמא	A2153
מברשת
נוגדן נגד קלבינדין D-28K (CB-955)	אבקאם	ab82812
חממת CO2	נואיר	NU-5700
קורנינג קוסטאר תחתון שטוח 6-באר צלחות תרבית תאים	פישר סיינטיפיק	07-200-83
כיסויים, 22 x 50 מ"מ	פישר סיינטיפיק	12-545-E
חבישת מלקחיים, ישר	מכשיר הרווארד	72-8949
להבים בעלי קצה כפול	פישר סיינטיפיק	50949411
הוכחת אתנול 200	Decon Labs, Inc	2701
מספריים לעיניים, ישר	מכשיר הרווארד	72-8428
מלקחיים עדינים	פישר סיינטיפיק	16-100-127
ל-גלוטמין 100X	ThermoFisher מדעי	25030149
תמיסת גלוקוז	ThermoFisher מדעי	A2494001
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס	ThermoFisher מדעי	14025092
Hoechst 33342, טריהידרוכלוריד, טריהידראט	פישר סיינטיפיק	H21492
סרום סוסים, מנוטרל חום, מוצא ניו זילנדי	ThermoFisher מדעי	26050088
ImageJ
מסוק רקמות McIlwain	פישר סיינטיפיק	NC9914528
מיקרו-גשושיות	פישר סיינטיפיק	08-850
תוספות תרבית תאי מיליצל	מיליפור סיגמא	PICM0RG50
יחידות סינון חד פעמיות סטריליות בזרימה מהירה של Nalgene עם קרום PES, 250 מ"ל	ThermoFisher מדעי	168-0045
מערכת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית Nikon A1R	ניקון
תוכנת הדמיה NIS-Elements	ניקון
פרפורמאלדהיד	אקרוס אורגניקס	41678-0010
פסטר פיפץ	פישר סיינטיפיק	13-678-20ד
אשלגן כלורי	פישר סיינטיפיק	BP366-500
ProLong זהב Antifade mountant	ThermoFisher מדעי	P10144
מספריים להפעלה, ישר	מכשיר הרווארד	72-8403
שייקר אורביטלי רקדנית בטן	אי.בי.אי סיינטיפיק	BDRLS0003
פריזמה 8	GraphPad
שקופיות מיקרוסקופ Superfrost Plus	פישר סיינטיפיק	12-550-15
צלחת תרבית רקמות, 60 מ"מ עם טבעת אחיזה	פישר סיינטיפיק	FB012921
צלחת תרבית רקמות, 24 באר	פלקון/קורנינג	353047
העברת פיפטות סטריליות	ThermoFisher מדעי	13-711-21
טריטון X-100	ThermoFisher מדעי	BP151-500