ניתוק וטיפוח תאי עצב מדגימות רקמת ההיפוקמפוס

תקציר

מקור: Servello, D. et al., מערכת מיקרוביומכנית לחקר היווצרות דליות והתאוששות באקסונים של תאי עצב מרכזיים. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את הדיסוציאציה והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מדגימות רקמת ההיפוקמפוס באמצעות דיסוציאציות אנזימטיות ומכניות. הטיפול עם Ara-C מעכב את הצמיחה של תאים שאינם עצביים, להקל על הצמיחה הסלקטיבית של נוירונים בהיפוקמפוס.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. דיסקציה, דיסוציאציה ותרבות של תאי עצב בהיפוקמפוס מעכבר/חולדה בהריון

1. דיסקציה ודיסוציאציה של נוירונים בהיפוקמפוס לתרבית
   1. הפשרת תמיסת אנזים פרוטאז (3 מ"ג/מ"ל פרוטאז 23 בתמיסת דיסקציה פרוסה, SLDS, טבלה 1) וציפוי טרום חם (טבלה 2) ב-37°C.
   2. לנתח את ההיפוקמפוס ולשטוף עם SLDS.
      הערה: ארבעה היפוקמפוסים מספקים מספיק תאים לצלחת אחת של 24 בארות או צלחת אחת של 6 בארות.
   3. הסר SLDS, הוסף 2 מ"ל של תמיסת אנזים פרוטאז, ודגר על הדגימה ב 37 ° C, 5% CO₂, במשך 15 דקות.
   4. לשטוף את explants ההיפוקמפוס עם 5-10 מ"ל של ציפוי בינוני פעמיים. מוסיפים 5 מ"ל של ציפוי בינוני. נתק את צמחי ההיפוקמפוס לתאים בודדים על ידי יצירת מערבולת קטנה באמצעות פיפטה עם קצה פלסטיק של 1 מ"ל. פיפטה מעלה ומטה כ -40 פעמים, הימנעות היווצרות של בועות חמצן, עד התמיסה הופכת מעורפלת ולא נותרו חתיכות גדולות של explant.
      הערה: זכור להשאיר כמה מדיה במהלך שטיפות, צמחים ההיפוקמפוס צריך להישאר שקוע בתווך במהלך כל התהליך.
   5. צנטריפוגה את התאים ב 1,125 x גרם במשך 3 דקות. להסיר את supernatant עם התאים שקועים במדיה. להשעות את התאים ב 145 מ"ל של ציפוי מדיה. הוסף 1 מ"ל / באר של תרחיף התא לצלחת 24 בארות (3 מ"ל / באר לצלחת 6 בארות).
      הערה: 145 מ"ל של חומרי ציפוי משמשים לייצור תרחיף תאים בעל צפיפות תאים נמוכה. נפח זה יאפשר ציפוי של תאים לשש צלחות של 24 בארות, שמונה צלחות של 6 בארות, או שילובים שונים של לוחות של 24 או 6 בארות, בהתאם לניסויים שייערכו. בכל באר של צלחת 24 בארות יהיה כ 3 x 10⁴ תאים.
   6. יש לדגור על התאים במצע הציפוי בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ למשך 2-4 שעות, ולאחר מכן להסיר את כל מדיית הציפוי ולהחליף אותה באמצעי תחזוקה טריים.
   7. לאחר יומיים (יומיים במבחנה, 2DIV), החלף מחצית מהמדיה ב- 2 מיקרומטר Ara-C (אראבינוסילציטוזין) מומס באמצעי תחזוקה, המעכב צמיחה של פיברובלסטים, אנדותל ותאי גלייה. לאחר חשיפת התאים ל-Ara-C במשך יומיים, יש להחליף את המדיה באמצעי תחזוקה טריים.

טבלה 1: תמיסת ציפוי כיסוי. מספק את המתכון להכנת תמיסת ציפוי הכיסוי המשמשת להדבקת תאים בתרבית לכיסויים.

פתרון ציפוי Coverslip
780 מיקרוליטר	חומצה אצטית17 mM מלאי: 50 μL חומצה אצטית ב 50 מ"ל של H2O
200 מיקרוליטר	פולי-D-ליזין (0.5 מ"ג/מ"ל מלאי)
20 מיקרוליטר	קולגן זנב חולדה (3 מ"ג/מ"ל מלאי)
הנפח הכולל נקבע על פי מספר הכיסויים שיש לצפות.

טבלה 2: מתכוני מדיה של תרביות תאים. מספק את המתכונים להכנת מדיה המשמשת לגידול תאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס.

1x פתרון דיסקציה פרוסה (SLDS), מסונן, pH = 7.4, מאוחסן ב 4 °C
1 ליטר	ddH2O
82 מ"מ	נא2SO4
30 מ"מ	יא2SO4
10 מ"מ	HEPES (חומצה חופשית)
10 מ"מ	D-גלוקוז
5 מ"מ	MgCl2
0.00%	פנול אדום (אופציונלי)
חומרי ציפוי (PM, מסנן, אחסון ב-4°C)
439 מ"ל	מלחי MEM ארל
50 מ"ל	פ.ב.ס.
11.25 מ"ל	20% D-גלוקוז
5 מ"ל	נתרן פירובט (100 מילימול,)
62.5 מיקרוליטר	ל-גלוטמין (200 מילימול)
5 מ"ל	פניצילין/סטרפטומיצין (P/S, 100x)
Maintenance Media (MM, filter, store at 4°C)
484 מ"ל	נוירובזל
10 מ"ל	תוסף B27 50x
1.25 מ"ל	ל-גלוטמין (200 מילימול)
5 מ"ל	מכפיל רווח של 100x
כל התמיסות מעוקרות באמצעות מסנן בגודל נקבוביות 0.2 מ"מ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כיסויים בקוטר 12 מ"מ	וורנר אינסטרומנטס	64-0702	לצלחת 24 בארות
כיסויים בקוטר 25 מ"מ	פישר סיינטיפיק	12-545-102	לצלחת 6 בארות
חומצה אצטית	פישר סיינטיפיק	A38-212
פולי-די-ליזין	סיגמא	P6407
קולגן זנב חולדה	רוש	11 179 179 001
10X PBS	אבחון לאומי	CL-253
Na2SO4	פישר סיינטיפיק	S373-500
K2SO4	פישר סיינטיפיק	עמ' 304-500
HEPES	פישר סיינטיפיק	BP410-500
D-גלוקוז	פישר סיינטיפיק	D16-500
MgCl2	פישר סיינטיפיק	BP214-500
נאוה	פישר סיינטיפיק	SS255-1
אנזים פרוטאז	סיגמא	P4032
פ.ב.ס.	גיבקו	26140
נתרן פירובט	גיבקו	11360-070
ל-גלוטמין	גיבקו	25030081
פניצילין/סטרפטומיצין 100x (P/S)	גיבקו	15140122
מלחי MEM ארל	גיבקו	11090
תוסף B27	גיבקו	17504-044
נוירובזל	גיבקו	21103-049
אראבינוסילציטוזין (Ara-C)	סיגמא	147-94-4
מדיה Opti-MEM	גיבקו	31985-070