התמיינות תאי גזע עובריים אנושיים לאוליגודנדרוציטים

תקציר

מקור: Assetta, B., et al. דור של נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים. J. Vis. Exp (2020).

סרטון זה מדגים את התהליך של יצירת תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (OPC) מתאי גזע עובריים אנושיים, ואחריו הבשלת OPCs לאוליגודנדרוציטים. תהליך זה של יצירת אוליגודנדרוציטים פותח דרכים רבות לשיפור המחקר והטיפול במחלות נוירודגנרטיביות, כולל אלצהיימר.

פרוטוקול

1. השראת תא מבשר אוליגודנדרוציטים אנושי (OPC) מתאי גזע פלוריפוטנטיים והבשלת אוליגודנדרוציטים

1. יצירת תאי אב עצביים (NPC): פרוטוקול חד-שכבתי (~ 7 ימים). ראו איור 1A עבור דיאגרמת הזרימה.
   1. השתמש בתאי H1 אנושיים ES הזמינים באופן מסחרי במעבר של 52 (ראה טבלת חומרים). תרבית את התאים על לוחות 6 בארות מצופות בתמיסת מטריצה חוץ-תאית (~0.5 מ"ג של תמיסת מטריצה לכל צלחת של 6 בארות; ראה טבלת חומרים) באמצעות מדיום תחזוקת תאי ES (ראה טבלת חומרים) ודגרה על הלוחות ב -37 ° C עם 5% CO₂.
   2. טרנס-התמיינות התאים לתאי אב עצביים (NPCs) על ידי גישה מבוססת הנקראת SMADi כפול, עם מעכבי מולקולות קטנות עבור מסלולי איתות מרובים. כאן אנו משתמשים בערכה מסחרית מקובלת ועוקבים אחר פרוטוקול monolayer המסופק על ידי היצרן (ראה טבלת חומרים).
   3. ביום -1, צלחת 0.5-1 x 10⁶ תאים לבאר בצלחת בת 6 בארות המצופה בתמיסת מטריצה מופחתת גורם גדילה (ראה טבלת חומרים; ~ 0.5 מ"ג של תמיסת מטריצה לכל צלחת בעלת 6 בארות) עם תווך תחזוקת תאי גזע עוברי (ES) (ראה טבלת חומרים). פתרון מטריצה מופחת גורם גדילה זה משמש לציפוי כל הצלחות שישמשו בשלבים הבאים.
   4. ביום 0, יש לטפל בתאים במשך 24 שעות עם מדיום תחזוקת תאי ES (ראו טבלת חומרים) בתוספת 2% דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
   5. ביום 1-6, החליפו את המדיה המלאה במדיום אינדוקציה עצבי חם (37°C) המכיל את מעכבי SMAD מהערכה המסחרית (ראו טבלת חומרים). אם התאים מתחלקים ומגיעים למפגש לפני יום 7, העבירו אותם לצפיפות הזריעה של 0.5-1 x 10⁶, כפי שתואר קודם לכן בשלב 1.1.3.
   6. ביום 7, עוברים NPCs באמצעות תמיסת ניתוק תאים (ראה טבלת חומרים) וצלחת בצפיפות זריעה של 1-2 x 10⁵ תאים/באר של צלחת בת 24 בארות.
   7. יעילות התמיינות הבדיקה על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) להיעדר סמני פלוריפוטנציה, כגון OCT4, ונוכחות סמני NPC, כגון PAX6, Nestin ו- Sox1.
   8. בשלב זה, ניתן להקפיא NPCs מנותקים במדיית ההקפאה המסחרית המיוחדת של NPC (ראה טבלת חומרים) ולאחסן בחנקן נוזלי למשך עד 3 חודשים. לאחר הקפאה והפשרה פעם אחת, NPCs עדיין שומרים על הרב-עוצמה כדי ליצור נוירונים, אסטרוציטים ו-OPC עם פרוטוקולים אמינים.
2. דור תא מבשר אוליגודנדרוציטים (OPC) (~ 7 ימים). ראו איור 1A עבור דיאגרמת הזרימה.
   1. ביום השביעי, עוברים NPCs באמצעות תמיסת ניתוק תאים (ראה טבלת חומרים) ולוחצים אותם בצפיפות זריעה של 1-2 x 10⁵ תאים לבאר בצלחת של 24 בארות בתווך אינדוקציה עצבי חם (37 מעלות צלזיוס) בתוספת מעכבי SMAD מהערכה המסחרית (ראה טבלת חומרים).
   2. ביום 8, הכינו תמיסה של 1% DMSO בתווך ההתמיינות OPC וטפלו ב-NPC המצופים במשך 24 שעות. מדיום התמיינות OPC מורכב מ: מדיום בסיסי (DMEM/F12), תוסף N2 1%, תוסף B27 1%, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) ב-20 ננוגרם/מ"ל, אגוניסט מוחלק (SAG) ב-1 מיקרומטר, גורם גדילה הנגזר מטסיות דם (PDGF-AA) ב-10 ננוגרם/מ"ל (ראה טבלת חומרים).
   3. ביום ה-9, החלף את המדיה באמצעי בידול OPC טרי ללא DMSO. האכילו את התאים אחת ליומיים עד היום ה-15. אם התאים מגיעים למפגש לפני יום 15, העבירו אותם לצפיפות זריעה של 1-2 x 10⁵ תאים לכל באר, כמתואר בשלב 1.2.1.
   4. ביום ה-14, לוחות OPC בתווך התמיינות OPC בצפיפות של 1-2 x 10⁵ תאים/באר בצלחת של 24 בארות.
   5. בשלב זה (יום 15), תאי בדיקה לנוכחות סמנים ספציפיים ל-OPC על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) או תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR) (למשל, O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; איור 1B) ועל היעדר סמני NPC (Pax6 או Nestin; איור 1D). בדרך כלל אנו מזהים את תגובתיות החיסון O4 ביותר מ-95% מהתאים ביום ה-15. רלוונטי במיוחד למחלת אלצהיימר, הביטוי של APP (חלבון מבשר עמילואיד), BACE1 (פרוטאז העיבוד β-secretase 1) ועמילואיד-β פפטידי (Aβ) נמצאים בשפע ב-OPC (איור 1F).
3. התבגרות אוליגודנדרוציטים (OL) (~7-20 ימים)
   1. ביום ה-15, יש להחליף את המדיה במדיום התבגרות OL: Neurobasal-A medium, תוסף B27 2%, 1 μM מחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP), 200 ng/mL T3 triiodothyronine, וקלמסטין של 1 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים). החליפו את המדיום כל יומיים או כל יום, במידת הצורך.
   2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 90%, יש לפצל ביחס של 1:3 עד 2 מעברים או עד שחלוקת התא מואטת באופן משמעותי. אם OPCs מתחלקים מהר מדי ומגיעים למפגש תוך פחות מ-3 ימים, הוסיפו Ara-C (ראו טבלת חומרים) בריכוז של 2-5 מיקרומטר למשך 1-3 ימים. ריבוי פעיל מצביע על יעילות התבגרות נמוכה יותר.
   3. לבחון את היעילות של התבגרות אוליגודנדרוגליאלית על ידי הערכת הביטוי של סמני OL, למשל, CLDN11, PLP1, MBP על ידי qPCR, צביעת IHC או immunoblotting. המורפולוגיה האופיינית של מבנים מורכבים מאוד (איור 1C) והביטוי של סמני OL (איור 1E) אמורים להיות מזוהים בקלות עד היום ה-28.

תוצאות

איור 1: יצירת iOPC (תא מבשר אוליגודנדרוציטים מושרה) והבשלת iOL (אוליגודנדרוציטים מושרים). (A) דיאגרמת זרימה של יצירת iOPC ו-iOL. (B) תמונות מייצגות של שדה בהיר ואימונופלואורסנציה של iOPCs ביום ה-15. Olig2 (סמן pan-oligodendroglia) מוצג בירוק, O4 (סמן OPC) באדום ו- DAPI בכחול. ההדמיה גילתה כי >95% מה- iOPCs חיוביים ל- O4 ו- 25% ל- Olig2. (C) תמונות...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אקוטאזה	טכנולוגיות STEMCELL	7920
תוסף B27	תרמופישר	17504044
bFGF	תרמופישר	PHG 0266
מחנה	MilliporeSigma	A9501
קלמסטין	MilliporeSigma	SML0445
DMEM/F12 בינוני	טכנולוגיות STEMCELL	36254
DMSO	תרמופישר	D12345
סרום בקר עוברי	ScienCell	10
תאי ES אנושיים H1	ויסל	WA01
מטריג'ל	קורנינג	354234
mTeSR פלוס	טכנולוגיות STEMCELL	5825
תוספת N2	תרמופישר	17502001
נוירובזל מדיום A	תרמופישר	10888-022
חומצות אמינו לא חיוניות	תרמופישר	11140-050
PDGF-AA	מערכות מו"פ	221-AA-010
pMDLg/pRRE	אדג'ין	12251
פוליברן	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	אדג'ין	12253
מעכב סלעים Y-27632	טכנולוגיות STEMCELL	72302
SAG	טוקריס	4366
STEMdiff Neural Progenitor הקפאת מדיה	טכנולוגיות STEMCELL	5838
ערכת השראה עצבית STEMdiff SMADi	טכנולוגיות STEMCELL	8581
T3 triiodothyronine	MilliporeSigma	T6397
Tempo-iOlogo: רכיבי OPC אנושיים שמקורם ב-iPSC	טמפו ביוסיינס	מק"ט102
טטו-נג2-פורו	אדג'ין	52047
VSV-G	אדג'ין	12259