$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. השראת נוירונים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
- הכנת Lentivirus (~ 5 ימים)
- צלחת ~ 1 מיליון כליות עובריות אנושיות 293T (HEK293T) תאים כל צלוחיות T75, כדי לקבל אותם ~ 40% מפגש בעת ביצוע transfection. הדבק אותם עם פלסמידים המבטאים נוירוגנין 2 (Ngn2) המושרה טטרציקלין וגן עמיד לפורומיצין (PuroR; תחת אותה בקרת מקדם אופרטור Tet (TetO), טרנסאקטיבטור טטרציקלין הפוך (rtTA) ושלושת פלסמידים מסייעים pRSV-REV, pMDLg/pRRE, ו- VSV-G (12 מיקרוגרם של DNA וקטורי לנטיויראלי ו -6 מיקרוגרם של כל DNA פלסמיד עוזר). הכינו לפחות שלוש צלוחיות לכל הכנת לנטיוירוס. השתמש פוליאתילנימין (PEI) עבור transfection בעקבות הוראות היצרן. שנה את המדיה לאחר 16 שעות ובטל.
- Harvest שחררה חלקיקים ויראליים על ידי איסוף מדיה תרבותית מדי יום והחליפה במדיה טרייה במשך 3 ימים. אגרו את המדיה שנאספה המכילה חלקיקים נגיפיים לטיהור. סנן את הנגיף דרך מסנן 0.22 מיקרומטר וצנטריפוגה במהירות 49,000 x גרם למשך 90 דקות. השהה מחדש את הגלולה בנפח המתאים של מלח חוצץ פוספט (PBS)-גלוקוז (~ 150 μL).
- אינדוקציה של נוירונים (~ 5 ימים)
הערה: פרוטוקול אינדוקציה זה (איור 1A; דיאגרמת זרימה) יעיל מאוד הן עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS) והן עבור תאי גזע עובריים (ES) של פלוריפוטנציה מאומתת (אשר ניתן לבדוק על-ידי צביעה אימונוהיסטוכימית של סמנים פלוריפוטנטיים מאופיינים היטב; איור 1B).
- השתמש בתאי H1 אנושיים ES הזמינים באופן מסחרי במעבר של 52 (ראה טבלת חומרים). תרבית את התאים בתמיסת מטריצה חוץ-תאית מצופה לוחות 6 בארות (~ 0.5 מ"ג של תמיסת מטריצה לכל צלחת 6 בארות; ראה טבלת חומרים) באמצעות מדיום תחזוקת תאי ES (ראה טבלת חומרים) ודגרה על הלוחות ב 37 ° C עם 5% CO2.
- ביום -2, יש לנתק תאי ES (80% במפגש) עם 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים (ראו טבלת חומרים) ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מעבירים את התאים לצינור; שוטפים את הבאר עם 2 מ"ל מדיה ומשלבים באותו צינור. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות, להשהות מחדש את הגלולה במדיה, ואת צלחת התאים על לוחות מצופים מטריצה 6 באר בצפיפות זריעה של 1 x 105 תאים לכל באר.
- ביום -1, הוסיפו לנטי-וירוסים המבטאים Ngn2 בתוספת PuroR ו-rtTA יחד עם פוליברן (8 מיקרוגרם/מ"ל) לתאי ES באמצעי תחזוקה טריים של תאי ES (ראו טבלת חומרים). המספר המדויק של וירוסים צריך להיקבע על ידי titers בפועל או טיטרציה. בדרך כלל אנו מוסיפים 5 μL כל וירוס לכל באר בצלחת של 6 בארות.
- ביום 0, הוסף דוקסיציקלין (2 מיקרוגרם/מ"ל, כדי להפעיל את ביטוי Ngn2) בתערובת הבינונית/תזונתית F-12 (DMEM-F12) של Dulbecco עם תוסף N2 ללא מורפוגנים.
- ביום הראשון, הוסף פורומיצין בתווך טרי של DMEM-F12 בתוספת N2 ודוקסיציקלין, לריכוז הסופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל בינוני. בחר את התאים המומרים בפורומיצין למשך 24 שעות לפחות. ייתכן שיידרשו ריכוז פורומיצין גבוה יותר (עד 5 מק"ג/מ"ל) ותקופת בחירה ארוכה יותר (עד 48 שעות) כדי להסיר כראוי את התאים שעברו תת-התמרות אם טיטר הנגיף נמוך.
- ביום השני, נתקו תאי עצב מתמיינים באמצעות תמיסת ניתוק תאים (ראו טבלת חומרים), וצלחו אותם מחדש על לוחות בעלי 24 בארות (בין 80,000 ל-200,000 תאים/באר) המצופים בתמיסת מטריצה (ראו טבלת חומרים), ושמרו אותם בתווך נוירובזל-A (NBA)/B27 ללא דוקסיציקלין. צפיפות הזריעה היא קריטית.
- בשלב זה, נוירונים מנותקים יכולים להיות מוקפאים בתווך הקפאה מסחרי מיוחד (ראה טבלת חומרים) ומאוחסנים בחנקן נוזלי למשך עד 3 חודשים. נוירונים טהורים יכולים להיות מצופים המהווים את ~15%-20% מוות תאי טיפוסי לאחר הפשרה, בתרבית בלבד או בתרבית משותפת עם סוגי תאי מוח אחרים (ראה שלב 3.2.3. עבור תרבית משותפת עם OPC).
- תרבית iNs טהורה על הצלחות מצופות בתמיסות חוץ-תאיות מבוססות מטריצה בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). המורפולוגיה הפירמידלית האופיינית צריכה להיות ברורה עד יום 4 (ויום 6; איור 1C). היווצרות הסינפסה יכולה להיות מזוהה כבר ביום 14 עד 16 והיא בולטת ביום 24 על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית עם סמנים סטנדרטיים לפני ואחרי סינפטיים. (איור 1D; מסומן עם הסמן הקדם-סינפטי Synapsin 1 והסמן הדנדריטי Map2).
2. השראת תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים אנושיים (OPC) מתאי גזע פלוריפוטנטיים והבשלת אוליגודנדרוציטים
- יצירת תאי אב עצביים (NPC): פרוטוקול חד-שכבתי (~ 7 ימים). ראו איור 2A עבור דיאגרמת הזרימה.
- תרבית תאי ES אנושיים מסוג H1 כפי שתואר קודם לכן (ראה שלב 1.2.1.) וטרנס-מיינת אותם לתאי אב עצביים (NPCs) על ידי גישה מבוססת הנקראת SMADi כפול, עם מעכבי מולקולות קטנות עבור מסלולי איתות מרובים. כאן אנו משתמשים בערכה מסחרית מקובלת ועוקבים אחר פרוטוקול monolayer המסופק על ידי היצרן (ראה טבלת חומרים).
- ביום -1, צלחת 0.5-1 x 106 תאים לבאר בצלחת בעלת 6 בארות המצופה בתמיסת מטריצה מופחתת גורם גדילה (ראה טבלת חומרים; ~ 0.5 מ"ג של תמיסת מטריצה לכל צלחת בעלת 6 בארות) עם מדיום תחזוקת תאי ES (ראה טבלת חומרים). פתרון מטריצה מופחתת גורם גדילה זה משמש לציפוי כל הצלחות שישמשו בשלבים הבאים.
- ביום 0, יש לטפל בתאים במשך 24 שעות עם מדיום תחזוקת תאי ES (ראו טבלת חומרים) בתוספת 2% DMSO.
- ביום 1-6, החליפו את המדיה המלאה באמצעי אינדוקציה עצבי חם (37°C) המכיל את מעכבי SMAD מהערכה המסחרית (ראו טבלת חומרים). אם התאים מתחלקים ומגיעים למפגש לפני יום 7, העבירו אותם לצפיפות הזריעה של 0.5–1 x 106, כפי שתואר קודם לכן בשלב 2.1.2.
- ביום 7, עוברים NPCs באמצעות תמיסת ניתוק תאים (ראה טבלת חומרים) וצלחת בצפיפות זריעה של 1-2 x 105 תאים/באר של צלחת בת 24 בארות.
- בדוק את יעילות ההתמיינות על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) עבור היעדר סמן פלוריפוטנציה, גורם שעתוק קושר אוקטמר 4 (OCT4) למשל, ונוכחות של סמני NPC כגון תיבה 6 מזווג (PAX6), נסטין, ואזור קביעת מין Y-box שעתוק פקטור 1 (Sox1).
- בשלב זה, ניתן להקפיא NPCs מנותקים במדיית ההקפאה המסחרית המיוחדת של NPC (ראה טבלת חומרים) ולאחסן בחנקן נוזלי למשך עד 3 חודשים. לאחר הקפאה והפשרה פעם אחת, NPCs עדיין שומרים על הרב-עוצמה כדי ליצור נוירונים, אסטרוציטים ו-OPC עם פרוטוקולים אמינים.
- דור תא מבשר אוליגודנדרוציטים (OPC) (~ 7 ימים). ראו איור 2A עבור דיאגרמת הזרימה.
- ביום השביעי, עוברים NPCs באמצעות תמיסת ניתוק תאים (ראה טבלת חומרים) ולוחצים אותם בצפיפות זריעה של 1-2 x 105 תאים לבאר בצלחת של 24 בארות בתווך אינדוקציה עצבי חם (37 מעלות צלזיוס) בתוספת מעכבי SMAD מהערכה המסחרית (ראה טבלת חומרים).
- ביום 8, הכינו תמיסה של 1% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בתווך התמיינות OPC וטפלו ב-NPC המצופה במשך 24 שעות. מדיום התמיינות OPC מורכב מ: DMEM/F12 בינוני, תוספת N2 1%, תוספת B27 1%, גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) ב-20 ננוגרם/מ"ל, אגוניסט מוחלק (SAG) ב-1 מיקרומטר, גורם גדילה הנגזר מטסיות דם-AA (PDGF-AA) ב-10 ננוגרם/מ"ל (ראה טבלת חומרים).
- ביום ה-9, החלף את המדיה באמצעי בידול OPC טרי ללא DMSO. האכילו את התאים אחת ליומיים עד היום ה-15. אם התאים מגיעים למפגש לפני יום 15, העבירו אותם לצפיפות זריעה של 1-2 x 105 תאים לבאר כמתואר בשלב 2.2.1.
- ביום ה-14, לוחות OPC בתווך התמיינות OPC בצפיפות של 1-2 x 105 תאים/באר בצלחת של 24 בארות.
- בשלב זה (יום 15), תאי בדיקה לנוכחות סמנים ספציפיים ל-OPC על ידי צביעת IHC או qPCR (למשל, O4, גורם שעתוק שושלת אוליגודנדרוציטים [Olig]-1/2, כונדרויטין סולפט פרוטאוגליקן 4/נוירון-גליה אנטיגן 2 [CSPG4/Ng2[, NK2 Homeobox 2 [NKX2.2], קולטן גורם גדילה נגזר טסיות אלפא [PDGFRa]; איור 2B) ועל היעדר סמני NPC (Pax6 או Nestin; איור 2D). בדרך כלל אנו מזהים את תגובתיות החיסון O4 ביותר מ-95% מהתאים ביום ה-15. רלוונטי במיוחד למחלת אלצהיימר, הביטוי של APP (חלבון מבשר עמילואיד), BACE1 (פרוטאז העיבוד β-secreatase 1) ופפטיד עמילואיד-β (Aβ) נמצא בשפע ב-OPC (איור 2F).
3. תרבית משותפת של נוירונים המושרים על ידי בני אדם (iNs) ותאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (iOPCs)
- ציפוי iOPC (~ 3 ימים)
- לוחות iOPC ביום 14 בצפיפות של 1 x 105 תאים לכל באר בלוח של 24 בארות (כמתואר לעיל בשלב 2.2.4.) בתווך התמיינות OPC (כמתואר בשלב 2.2.2).
- הקמת תרבות משותפת iN-iOPC
- ביום ה-15, נתקו את תאי העצב האנושיים המושרים בשלב של יום 2 לאחר בחירת הפורומיצין (כמתואר בשלב 1.2.6.) עם תמיסת ניתוק תאים (ראו טבלת חומרים).
- הוסף נוירונים ל- OPC בתרבית, ציפוי בצפיפות זריעה של 2 x 105 תאים לכל באר בצלחת 24 בארות עם OPC גדל (משלב 3.1.1). השתמש במדיום התרבית המשותפת המכיל Neurobasal-A בינוני, 2% תוסף B27, ו 100 ng / mL T3 triiodothyronine. החליפו את המדיום למחרת ואז פעם ביומיים לאחר מכן. אם OPCs מתרבים מהר מדי ומגיעים למפגש תוך פחות מ-3 ימים, הוסיפו ציטוזין ארבינוזיד (Ara-C) בריכוז של 2-5 מיקרומטר. תמונה מייצגת של iNs ו-iOPCs שגדלו בתרבית משותפת לאחר 7 ימי עצב מוצגת באיור 3A.
- השתמש בתאי עצב קפואים שהוכנו כמתואר לעיל בשלב 1.2.7 לתרבית משותפת עם OPC. צלחת להקפיא ולהפשיר נוירונים בצפיפות גבוהה יותר של 3 x 105 תאים לכל באר.
- לאחר יום 14-16 בתרביות משותפות, ניתן לראות את היווצרות הסינפסות ב-iNs על-ידי צביעת IHC של סמנים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, וביום ה-21 הפונקטה הסינפטית צריכה להיות שופעת (איור 3C) ופעילויות עצביות יכולות להיות מתועדות באופן אמין.
- החל מהיום ה-21, בדקו תאים לסמנים ספציפיים ל-OL (לדוגמה, חלבון בסיסי של מיאלין [MBP] וחלבון פרוטאוליפידים 1 [PLP1]). ביום ה-28 אנו בדרך כלל צופים בתופעה של מעטפת אקסוני iN על-ידי תהליכי iOL, המסומנים על-ידי צביעת IHC עבור סמנים ספציפיים (איור 3B; נוירופילמנט [NF] עבור אקסוני iN ו-MBP עבור תהליכי iOPC).
