טכניקה ליצירת מונושכבה דו-ממדית של תאי המוח הקטן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

תקציר

מקור: Madencioglu, D. A., et al. מידול התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה במבנה דו-ממדי.J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים פרוטוקול להבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לאבות המוח הקטן. זה כרוך בהעברת מושבות תאי גזע ללוחית התקשרות נמוכה במיוחד ליצירת גופים עובריים, קידום התמיינות עם גורמי גדילה, ולאחר מכן העברת גופי העובר לצלחת מצופה מטריצה להידבקות. השלבים הבאים כוללים גרימת נדידת תאים והוספת מדיום הבשלה כדי להנחות את התפתחותם של מבשרי תאי עצב גלוטמטרגיים ו- GABAergic cerebellar ואבות תאי Purkinje.

פרוטוקול

1. הכנה ניסיונית

1. הכן לוחות ממברנות מרתף (BMM)-מצופים.
   הערה: BMM מתמצק מהר יותר בטמפרטורות חמות יותר. צלחות חייב להיות מוכן במהירות מיד להציב ב 4 ° C לאחסון.
   1. הפשירו את ה-BMM (ראו טבלת חומרים) על קרח, בטמפרטורה של 4°C למשך שעתיים לפחות, או למשך הלילה.
   2. ערבבו את ה-Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 וה-BMM של Dulbecco לריכוז סופי של 80 מיקרוגרם/מ"ל. יש לפזר את תמיסת ה-BMM בצלחות תרבית רקמה (1 מ"ל ל-35 מ"מ ו-2 מ"ל לכלים בקוטר 60 מ"מ) ולדגור ב-37°C למשך שעה לפחות או לילה לפני ציפוי התאים.
      הערה: ניתן לאחסן את הכלים שאינם בשימוש ב -4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים.
2. הכינו לוחות מצופים פולי-L-אורניתין/למינין (אש"ף/למינין).
   1. הכינו אש"ף של 20 מיקרוגרם/מ"ל (ראו טבלת חומרים) במי מלח חוצצים פוספט סטרילי של דולבקו (DPBS+/+) והוסיפו 1 מ"ל לכל באר של צלחת בעלת 6 בארות. יש לדגור לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
   2. למחרת, שאפו את אש"ף עם שואב ואקום ושטפו פעמיים עם DPBS+/+. ייבוש באוויר במכסה המנוע.
      הערה: ניתן לאחסן צלחות מיובשות באוויר בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים, עטופות ברדיד אלומיניום, לשימוש עתידי.
   3. הכינו למינין של 10 מיקרוגרם/מ"ל (ראו טבלת חומרים) ב-DPBS+/+ והוסיפו 1 מ"ל לכל באר של צלחת בעלת 6 בארות. יש לדגור לפחות במשך 3 שעות או לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
   4. שאפו את הלמינין עם שואב ואקום והוסיפו 1 מ"ל של DPBS בינוני או סטרילי +/+.
      הערה: אסור שציפוי הלמינין יתייבש. PBS או מדיום תרבות מתאים יש להוסיף מיד כדי למנוע זאת. צלחות מצופות ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 2 שבועות.
3. הכן פתרון העברת PSC.
   1. ממיסים 11.49 גרם אשלגן כלורי (KCl) ו-0.147 גרם נתרן ציטראט דיהידרט (HOC(COONa) (CH₂COONa)₂*2H₂O) ב-400 מ"ל מים סטריליים בדרגת תרבית תאים (ראו טבלת חומרים).
   2. מדוד את עוצמת הקול של התמיסה ורשום אותה כאמצעי האחסון הראשוני (Vi).
   3. למדוד את האוסמולריות ולהתאים אותה ל 570 mOsm על ידי הוספת מים כיתה תרבית תאים סטרילית באמצעות הנוסחה Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
   4. סנן לעקר את הפתרון עם מסנן 0.20 מיקרומטר ולעשות 10 מ"ל aliquots. אחסן את aliquots בטמפרטורת החדר (RT) עד 6 חודשים.
4. הכנת תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC) medium.
   הערה: iPSCs נשמרים בתווך המכיל גורם גדילה פיברובלסט יציב בחום 2 (FGF2) (ראה טבלת חומרים), ומספק לוח זמנים להאכלה ללא סופי שבוע. מדיות PSC אחרות הזמינות מסחרית לא נוסו עבור פרוטוקול זה.
   1. הפשירו את התוסף הבינוני PSC למשך הלילה ב-4°C.
   2. הוסף 10 מ"ל של תוסף PSC בינוני ל 500 מ"ל של PSC בינוני בסיסי. הכינו 25 מ"ל aliquots ואחסנו ב -20 °C.
      הערה: aliquots קפוא ניתן לאחסן ב -20 ° C במשך 6 חודשים. aliquots מופשר יש לאחסן ב 4 ° C ולהשתמש בתוך 2 שבועות. ניתן להקפיא תאים לאחסון לטווח ארוך בתווך PSC עם 10% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO).
5. הכינו מדיום הפשרה PSC.
   1. תוסף PSC בינוני עם 50 ננומטר כרומן, 1.5 מיקרומטר אמריקסן, תוסף פוליאמין 1x ו-0.7 מיקרומטר טרנס-איסריב (קוקטייל CEPT) (ראה טבלת חומרים).
   2. יש לסנן ולעקר עם מסנן 0.20 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 4 שבועות.
6. הכינו פיפטות זכוכית משוכות.
   1. משוך פיפטות פסטר זכוכית בגודל 22.9 ס"מ לשתי חתיכות מעל מבער בונזן, ~2 ס"מ מתחת לצוואר, ויוצר שתי פיפטות כאשר הצד הדק יותר קצר ~ 4 ס"מ מהשני.
   2. בעזרת הלהבה, לכופף את קצות הצד הנמשך כדי ליצור "r" חלק.
   3. מניחים את פיפטות משוך שרוולי autoclave autoclave עבור עיקור.
7. הכן מדיום התמיינות המוח הקטן (CDM).
   1. ערבבו את Medium (IMDM) של Iscove's Modified Dulbecco ואת תערובת החומרים המזינים F12 של Ham ביחס של 1:1. השלימו את התערובת עם תוסף L-אלנין-L-גלוטמין, 1% (v/v) תרכיז שומנים מוגדר כימית, 0.45 mM 1-thio-glycerol, 15 μL / mL apo-transferrin, 5 מ"ג / מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA), ו 7 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין (ראה טבלה של חומרים).
   2. יש לעקר את המסנן עם מסנן 0.20 מיקרומטר, לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך חודש.
8. הכן מדיום התבגרות המוח הקטן (CMM).
   1. תוסף נוירו-בסיסי בינוני עם 1x L-אלנין-L-גלוטמין תוספת 1x N-2 (ראה טבלה של חומרים).
   2. יש לעקר את המסנן עם מסנן 0.20 מיקרומטר, לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך שבועיים.

2. תרבות iPSC ללא הזנה

1. הפשיר את התאים לפי השלבים הבאים.
   1. הכניסו צלחת BMM (שלב 1.1) לאינקובטור של 37°C לג'ל למשך שעה או לילה לפחות לפני הפשרת התאים.
   2. חימום מראש של 10 מ"ל של PSC מפשיר בינוני (שלב 1.5) ב 37 ° C.
   3. להעביר את cryovial עם תאים מחנקן נוזלי לאמבט מים ב 37 ° C.
      הערה: כדי להימנע מיצירת מקור זיהום בחלל תרבית התא, לא מומלץ להשתמש באמבט מים סטנדרטי. במקום זאת, ניתן לחמם מים מתוקים בכוס קטנה ל -37 מעלות צלזיוס כדי ליצור אמבט מים לשימוש חד פעמי.
   4. כאשר נשארת חתיכת קרח קטנה בצינור, הוציאו אותה מאמבט המים, יבשו את הצינור ורססו באתנול 70%. העבירו את הצינור למכסה המנוע והשתמשו בפיפטה סרולוגית של 2 מ"ל או 5 מ"ל (ראו טבלת חומרים) כדי להעביר בעדינות את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
   5. הוסף 8 מ"ל של מדיום הפשרת PSC לתאים תוך כדי ערבול הצינור החרוט. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
   6. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט עם שואב ואקום מבלי להפריע לכדורית התא. להשעות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של PSC הפשרה בינוני.
   7. שאפו את ה-BMM מהצלחת והוסיפו את התאים המרחפים מחדש בכל רחבי הצלחת לפיזור אחיד.
   8. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO₂. רענן את המדיום למחרת עם מדיום PSC. לאחר מכן, לשנות את המדיום מדי יום.
2. שמור על התאים לפי השלבים הבאים.
   1. חממו מראש את הנפח הדרוש של PSC בינוני ב-37°C (למשל, 1 מ"ל בינוני לכל צלחת של 35 מ"מ).
   2. חקור את הלוחות עבור תאים ממוינים או מושבות והסר את התאים המומיינים עם פיפטת זכוכית משוכה (שלב 1.6).
      הערה: למושבות iPSC יש קצוות חלקים עם תאים זהים מורפולוגית.
   3. שנה את התווך המושקע מדי יום ומעבר כל 3-4 ימים או כאשר מגיעים למפגש של 70%.
3. מעבר בין התאים.
   1. הכניסו את הכמות הדרושה של לוחות BMM לאינקובטור למשך שעה אחת לפחות או לילה לפני המעבר. מראש לחמם את הכמות הדרושה של PSC בינוני (שלב 1.3) ב 37 °C.
   2. בעזרת פיפטת זכוכית משוכה, נקו תאים או מושבות ממוינים.
   3. שואפים את המדיום המשומש עם שואב ואקום ומוסיפים מדיום דיסוציאציה PSC, 1 מ"ל לכל צלחת 35 מ"מ. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 1-3 דקות
      הערה: אם מושבות מתרוממות בתמיסת המעבר PSC לפני הוספת מדיום PSC, ניתן לקצר את זמן הדגירה.
   4. שאפו את תמיסת המעבר של PSC והוסיפו מדיום PSC שחומם מראש.
   5. בעזרת קצה פיפטה סטרילי של 200 μL, מחברים קווי גירוד מקבילים זה לזה בכיוון אחד, מסובבים את הצלחת ב-90°, ויוצרים קבוצה שנייה של קווי גירוד בניצב לקודמים (מה שיוצר תבנית צולבת לרוחב הצלחת).
   6. שאפו את תמיסת ה-BMM מהלוחות שנקבעו. אספו את המושבות באמצעות פיפטה סרולוגית והפיצו אותן ללוחות BMM חדשים.
   7. יש לדגור ב-37°C, 5% CO₂. שנה את המדיום מדי יום.
4. להקפיא את התאים.
   1. הכינו קריובלים על ידי תיוג התוכן וסטריליזציה תחת אור אולטרה סגול (UV) במכסה המנוע (ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות.
   2. הכינו את מדיום ההקפאה של PSC על ידי תוספת PSC בינוני עם 10% (v/v) DMSO. בצע את שלבים 2.3.2-2.3.5.
   3. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל עם פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל וצנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
   4. בזהירות לשאוף את המדיום ולהשעות מחדש את גלולת התא בתווך הקפאה PSC.
   5. להפיץ לתוך cryovials. הכניסו את הבקבוקונים למיכל הקפאה והכניסו את המיכל למקפיא בטמפרטורה של -80°C.
   6. למחרת, להעביר את cryovials לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

3. הבחנה צרבלרית

הערה: לפני תחילת הבידול, iPSCs עוברים לשש צלחות 35 מ"מ ומוכנים לבידול כאשר הם במפגש של 70%. כל צלחת 35 מ"מ תועבר לבאר אחת מתוך צלחת 6 הקידוחים.

1. ביום 0, הרימו את מושבות iPSC הבריאות ליצירת EB.
   1. הוסף 1 מ"ל CDM (שלב 1.7) בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 ו- 10 מיקרומטר SB431542 (ראה טבלת חומרים) לכל באר של צלחת חיבור 6 בארות נמוכה במיוחד (ULA) ומניחים באינקובטור עד שהמושבות המורמות מוכנות להוספה לבארות.
   2. נקו את התאים המתמיינים באמצעות פיפטת זכוכית משוכה. שאפו את המדיום והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת מעבר PSC לכל צלחת של 35 מ"מ. לדגור במשך 3 דקות ב 37 ° C, לשאוף, ולהוסיף 2 מ"ל של CDM בתוספת 10 μM Y-27632 ו 10 μM SB431542.
      הערה: אם מושבות מתרוממות בתמיסת המעבר PSC לפני הוספת CDM, ניתן לקצר את זמן הדגירה.
   3. תחת מיקרוסקופ הפוך של אור מועבר, הרימו בעדינות את המושבות באמצעות הקצה הכפוף של פיפטת הזכוכית המשוכה באמצעות הגדלה פי 4. לאחר שכל מושבה מורמת, מעבירים בעדינות את כולה לבאר אחת מתוך צלחת ULA בעלת 6 בארות באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. חזור על תהליך זה עבור כל צלחת iPSC. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂.
      הערה: אם המושבות גדולות מדי או מתמזגות, ניתן לחתוך אותן עם קצה פיפטת הזכוכית המושכת כדי ליצור EBs קטנים יותר.
2. ביום השני, יש להוסיף FGF2 לכל באר לריכוז סופי של 50 ng/mL.
   הערה: FGF2 המשמש להתמיינות המוח הקטן אינו יציב בחום. פרוטוקול זה לא נבדק עם FGF2 יציב בחום.
3. ביום השביעי, לעשות שינוי בינוני 1/3. עבור 3 מ"ל של מדיום כולל בבאר, עם pipettor 1,000 μL, לשאוף בעדינות 1 מ"ל של מדיום משומש ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של CDM טרי. לדגור על EBs במשך 7 ימים.
4. ביום ה-14, שאפו בעדינות כמעט את כל המדיום המשומש באמצעות פיפטור של 1,000 מיקרוליטר. כדי להבטיח נזק מינימלי ל- EBs, סובבו את הצלחת כדי לאסוף את כל ה- EBs במרכז הצלחת, ולאחר מכן הטו את הצלחת ושאפו לאט מהקצה.
   1. ככל שהכמות הבינונית יורדת, הניחו לאט את הצלחת שטוחה והמשיכו לשאוף. השאירו מספיק מדיום כדי למנוע ייבוש של EBs החוצה. לאחר מכן, הוסף 3 מ"ל של CDM טרי בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632. העבר את ה- EBs באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל לצלחת מצופה אש"ף/למינין (שלב 1.2).
      הערה: בהתאם ליישום במורד הזרם, ניתן להעביר את ה- EBs לצלחת אש"ף / למינין 6 בארות או EBs בודדים ניתן להעביר לבאר אחת של צלחת או כיסוי מצופה אש"ף/למינין 24 בארות.
5. ביום ה-15, שאפו את המדיום והחליפו אותו ב-CDM.
   טרי הערה: חשוב להוסיף מספיק מדיום לבארות כדי להבטיח מספיק תווך בין האכלות, שכן לאורך זמן יהיה אידוי (למשל, עבור באר בצלחת של 6 בארות, להוסיף 3 מ"ל של מדיום). אם המדיום התחיל להחמיץ, יש לרענן את המדיום גם אם הוא לא נמצא בלוח הזמנים של ההאכלה עד סוף הפרוטוקול.
6. ביום ה -21, שאפו את המדיום שהוצא והחליפו אותו ב-CMM. ביום ה-28, החליפו את המדיום ב-CMM טרי. ביום ה-35, קצרו את התאים ליישומים נוספים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10 מ"ל פיפטה סרולוגית	פישר סיינטיפיק	13-678-26ד
1-תיו-גליצרול	סיגמא	M6145
2 מ"ל פיפטה סרולוגית	פישר סיינטיפיק	13-678-26ב
250 מ"ל יחידת פילטר, 0.2 מיקרומטר aPES, קוטר 50 מ"מ	פישר סיינטיפיק	FB12566502
צלחת קלוטורה רקמה קלה לאחיזה 35 מ"מ	בז	353001
5 מ"ל פיפטה סרולוגית	פישר סיינטיפיק	13-678-25ד
צלחת תרבית רקמה קלה לאחיזה 60 מ"מ	בז	353004
6 צלחות חיבור נמוכות במיוחד	קורנינג	3471
9 "פייפטים חד פעמיים של פסטר	פישר סיינטיפיק	13-678-20ד
אפו-טרנספרין	סיגמא	T1147
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא	A9418
מים בדרגת תרבית תאים	ציטיבה	SH30529.02
תרכיז שומנים מוגדר כימית	גיבקו	11905031
כרומן 1	קיימן	34681
סוג II, סוג A2, ארון בטיחות ביולוגי	NuAire, Inc.	NU-540-600	מכסה מנוע, אור UV
צלחת Costar 24-well, TC מטופל	קורנינג	3526
צלחת Costar 6-well, TC מטופל	קורנינג	3516
DMEM	גיבקו	11965092
DMEM/F12	גיבקו	11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide)	סיגמא	D2438
DPBS+/+	גיבקו	14040133
אמריקסאן	קיימן	22204
ערכת תכנות מחדש אפיזומלית iPSC Episomal	לייף טכנולוגיות	A15960
8-Flex חיוני	גיבקו	A2858501	PSC בינוני עם FGF2 עמיד בחום
סרום בקר עוברי - Premium Select	אטלנטה ביולוגיה	S11150
FGF2	פפרוטק	100-18 ב'
תוסף GlutaMAX	גיבקו	35050061	תוסף L-אלנין-L-גלוטמין
תערובת תזונתית F12 של בשר חזיר	גיבקו	11765054
חממת HERAcell VIOS 160i CO2	תרמו סיינטיפיק	50144906
IMDM	גיבקו	12440053
אינסולין	גיבקו	12585
חלבון עכבר למינין	גיבקו	23017015
מטריג'ל מטריקס	קורנינג	354234	מטריצת קרום מרתף
מם-נאה	גיבקו	11140050
מיני צנטריפוגה	לאבנט אינטרנשיונל	C1310	ספסל מיני צנטריפוגה
תוספת N-2	גיבקו	17502-048
מדיום נוירובזאלי	גיבקו	21103049
PBS, pH 7.4	גיבקו	10010023
PFA 16%	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	15710
תוסף פוליאמין	סיגמא	P8483
פולי-L-אורניתין (אש"ף)	סיגמא	3655
אשלגן כלורי	סיגמא	746436
SB431542	סיגמא	54317
לראות דרך שקיות הניתנות לאטימה עצמית	סטריקינג	SS-T2 (90x250)	שקיות Autoclave
נתרן ציטראט דיהידראט	פישר סיינטיפיק	S279-500
מסנני מזרק, סטרילי, PES 0.22 מיקרומטר, קוטר 30 מ"מ	מוצרי מחקר בינלאומיים	256131
טרנס-איסריב	קיימן	16258
אוסמומטר לחץ אדים	Wescor, Inc.	דגם 5520	אוסמומטר
Y-27632	ביוג'מס	1293823