יצירת תאי עצב ותאי גליה מגופי עובר פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

תקציר

מקור: Pistollato, F., et al. פרוטוקול להתמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתרביות מעורבות של נוירונים וגליה לבדיקת רעילות עצבית. J. Vis. Exp.(2017)

סרטון זה מדגים את תהליך התמיינות גופים עובריים (EBs) לצברים נוירואפיתליאליים וחלוקתם לאחר מכן לתאי עצב וגלייה. שיטה זו מאפשרת יצירה יעילה של תאי עצב וגליה במבחנה, המשמשים כמערכות בדיקה לבדיקת רעילות וכן להערכה של מסלולים שונים המעורבים ברעילות עצבית.

פרוטוקול

1. התמיינות HiPSC לנוירונים מעורבים ותאי גליה

הערה: השלמת ההליך נמשכת כ-28 יום, כאשר השלבים העיקריים מתוארים באיור 1.

1. יצירת גופים עובריים (EBs) (ימים 0 → 1)
   הערה: הליך זה דורש מיומנויות ידניות טובות ודיוק. HiPSC (תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם) מקטעי מושבה צריכים להיות בגודל שווה כדי לקבל גופים עובריים הומוגניים (EBs) בשלבים הבאים. מושבות מובחנות מורפולוגית (עם שברים ציטופלזמיים גדולים וגרעינים קטנים) יש להשליך.
   1. רענן את תווך hiPSC (צלחת פטרי של 3 מ"ל/60 מ"מ) לפני חיתוך מושבות hiPSC בלתי מובחנות (קוטר של כ-1 מ"מ, ראה איור 2A) בתנאים סטריליים.
   2. חתכו את המושבות הבלתי ממוינות (כפי שמוצג באיור 2A ובאיור 2B) למקטעים של בערך 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר באמצעות מזרק של 1 מ"ל עם מחט של 30 גרם. השתמש במיקרוסקופ סטריאוסקופי בהגדלה פי 4 בארון זרימה למינרי בטמפרטורת החדר.
   3. נתקו את שברי המושבה משטח הצלחת באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר על ידי פיטום עדין מתחתיה כדי להרים את החתיכות.
   4. מעבירים את כל השברים המנותקים ואת המדיום לצינור של 15 מ"ל באמצעות פיפטה של 1, 2 או 5 מ"ל.
   5. שטפו את המנה עם 2 מ"ל של מדיום hiPSC מלא כדי לשחזר את כל השברים.
   6. צנטריפוגה ב 112 x גרם במשך 1 דקה.
   7. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש בעדינות את השברים ב-5 מ"ל של מדיום hiPSC EB שלם (ראו טבלת חומרים).
   8. מקציפים את שברי המושבה בצלחת פטרי חיבור אולטרה נמוכה בקוטר 60 מ"מ (צלחת פטרי 5 מ"ל/60 מ"מ).
   9. יש לדגור על צלחת הפטרי למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
   10. למחרת (יום 1), לאסוף את EBs ואת המדיום שלהם בצינור 15 מ"ל באמצעות פיפטה 1, 2, או 5 מ"ל.
   11. צנטריפוגה EBs ב 112 x גרם במשך 1 דקה.
   12. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והשהו מחדש בעדינות את ה-EBs ב-5 מ"ל של מדיום hiPSC EB מלא באמצעות פיפטה של 1, 2 או 5 מ"ל.
   13. החזירו את ה-EBs לצלחת פטרי חדשה בקוטר 60 מ"מ עם חיבור נמוך במיוחד (צלחת פטרי 5 מ"ל/60 מ"מ).
   14. יש לדגור על צלחת הפטרי למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
2. ביום הראשון, צפו את הכלים במטריצת קרום מרתף (למשל, מטריג'ל, המכונה להלן "מטריצה סטנדרטית") או בכל מצע חלבוני מתאים אחר (למשל, למינין).
   1. אחסנו את המטריצה הסטנדרטית (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של -80°C באליציטוטים של 200 מיקרוליטר באמצעות צינורות קרים של 1.5 מ"ל ופיפטות קרות של 5 או 10 מ"ל.
   2. הפשרה 200 μL של מטריצה סטנדרטית על קרח.
   3. לדלל 200 μL של מטריצה סטנדרטית ב 20 מ"ל של בינוני בסיסי (DMEM/F12) (דילול 1:100).
   4. מצפים צלחות פטרי בקוטר 60 מ"מ בתמיסה זו (5 מ"ל/צלחת).
   5. לדגור את הכלים המצופים ב 37 ° C למשך הלילה.
      הערה: מנות אלה ישמשו לצלחת EBs (כ -50 EBs למנה) ולייצר אגרגטים נוירואפיתל (רוזטות); ראה שלב 1.3.
3. יצירת אגרגטים נוירואפיתליאליים (רוזטות) (ימים 2 → 7)
   1. ביום השני, הסירו את תמיסת ציפוי המטריצה הסטנדרטית מכלי פטרי בקוטר 60 מ"מ (אין צורך לשטוף את הצלחות) ומלאו אותם ב-5 מ"ל/צלחת של מדיום אינדוקציה נוירואפיתל מלא (NRI); ראו טבלת חומרים.
   2. העבר את ה- EBs הצפים (משלב 1.1.14) לכלים מצופים (~ 50 EBs / צלחת) באמצעות פיפטה של 200 μL תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בהגדלה פי 4 והניח בארון זרימה למינרית.
      הערה: זה קריטי לבחור EBs הומוגניים בגודל בינוני (~ 200-300 מיקרומטר קוטר). EBs קטנים מדי עשויים שלא לשרוד היטב במהלך התמיינות neuroectodermal, בעוד EBs גדולים מדי נוטים לעבור נמק הליבה.
   3. לדגור את הכלים ב 37 ° C ו 5% CO₂.
   4. ביום שאחרי (יום 3), בדקו את הכלים תחת המיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 כדי לוודא שכל ה-EBs מחוברים.
   5. בצע בעדינות שינוי בינוני כולל עם מדיום NRI מלא.
   6. שנה את מדיום NRI כל יומיים עד יום 7, כאשר אגרגטים נוירואפיתל (רוזטות) צריך להיות גלוי.
   7. ביום השביעי, יש לצפות מטריצה סטנדרטית (או למינין), כמתואר בשלב 1.2, על כל תבנית צלחת או צלחת נדרשת: צלחות 96 בארות (100 מיקרוליטר/באר), צלחות 24 בארות (250 מיקרוליטר/באר), צלחות 12 בארות (500 מיקרוליטר/באר), שבבי MEA (לפעילות חשמלית, 1 מ"ל/שבב באר יחידה), או צלחות פטרי 60 מ"מ (4 מ"ל/צלחת).
   8. לדגור על הצלחות/הכלים המצופים במשך שעתיים לפחות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
4. דיסוציאציה רוזט והתמיינות עצבית (ימים 8 → 28)
   הערה: הליך זה דורש מיומנויות ידניות טובות ודיוק. כדי להימנע מאיסוף תאים מזודרמליים ואנדודרמליים, יש לנתק ולאסוף רק מבנים דמויי רוזטה אקטודרמיים.
   1. ביום 8, חתכו את המבנים דמויי הרוזטה לשברים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בהגדלה של פי 10 בתנאים סטריליים. השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 30G. שימו לב שהרוזטות נוטות להתנתק מהצלחת כאשר נוגעים בהן עם המחט בקלות.
   2. השלם את ניתוק שברי הרוזטה באמצעות פיפטה של 200 μL.
   3. מעבירים את התבשיל מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית ואוספים את שברי הרוזטה ואת המדיום שלהם לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות פיפטה של 1, 2 או 5 מ"ל. שטפו את התבשיל עם 2 מ"ל של מדיום NRI כדי לשחזר את כל השברים.
   4. סובבו את שברי הרוזטה במהירות של 112 x גרם למשך 2 דקות.
   5. שאפו את הסופר-נאנט.
   6. השהה מחדש בעדינות את הגלולה ב-1 מ"ל של DPBS 1x (ללא סידן ומגנזיום) ופיפט בעדינות את שברי הרוזטה מעלה ומטה באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי לנתק אותם חלקית.
   7. הוסף 4 מ"ל של מדיום NRI שלם וספור את התאים באמצעות כחול טריפאן ומונה תאים אוטומטי (ראה טבלת חומרים)
      הערה: לדלל 20 μL של תרחיף התא ב 20 μL של כחול טריפאן. שלב זה עשוי להיות מושמט אם לא ניתן להכניס את התאים להשעיה של תא יחיד. אם שברי הרוזטה אינם נראים מנותקים לחלוטין, ניתן לתלות מחדש שברי רוזטה שמקורם בכ-50 EBs/60 מ"מ צלחת ב-50 מ"ל של תווך NRI שלם ולצפה, כפי שמצוין בטבלה 1.
   8. שאפו את תמיסת הציפוי הסטנדרטית (או למינין) מצלחות, צלחות ו/או שבבי MEA של פטרי (משלב 1.3.7). אל תתנו להם להתייבש.
   9. לוחו את התאים בתווך NRI שלם בהתאם לתוכנית המחקר (כ-15,000 תאים לסמ"ק²; ראו טבלה 1 לציפוי חיווי נפח).
   10. לדגור על הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
   11. ביום ה-10, בצעו שינוי מדיום כולל באמצעות מדיום התמיינות עצבית מלא (ND); ראו את טבלת החומרים.
   12. רענן את מדיום ND מלא פעמיים בשבוע עד יום 28.

טבלה 1.

הערה לגבי צפיפות ציפוי רוזטה מנותקת: אם שברי רוזטה אינם נראים מנותקים לחלוטין, על מנת להגיע לצפיפות ציפוי תאים של כ-15,000 תאים לסמ"ר, ניתן לתלות מחדש שברי רוזטה מנותקים הנובעים מכ-50 EBs/1 x 60mm-צלחת ב-50 מ"ל של תווך NRI מלא ולצפות אותם באופן הבא (בהתאם לפורמט הצלחת):

צלחות מרובות / MEA	שטח גידול (סמ"ר/באר)	נפח תרחיף התא לצלחת לכל באר (או שבב MEA)	מספר מרבי של צלחות שניתן לצפות (עם 50 מ"ל של תרחיף התא)
96 וולות	0.3	100 ul	5
48 בארות	0.7	220 UL	4
24 בארות	2	625 UL	3
12 בארות	4	1.25 מ"ל	3
6 בארות	10	3.125 מ"ל	2
שבב MEA באר יחידה	3.5	1.1 מ"ל	45

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול התמיינות עצבית. (חלק עליון) מושבות IMR90-hiPSC ניתנות לחיתוך לשברים ליצירת גופים עובריים (EBs). לאחר יומיים במבחנה (DIV), ניתן לצפות EBs על כלים מצופים למינין או מטריצה סטנדרטית ולגדל בתרבית בנוכחות תווך אינדוקציה נוירואפיתל (NRI) כדי ליצור נגזרות נוירואקטודרמליות (רוזטות, כאן מוכתמות עבור nestin (ירוק) ו β-III-tubulin (אדום)). רוזטות יכולות להיות מנותקות, נאס...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
hiPSC EB בינוני:
נוקאאוט DMEM	תרמו-פישר	10829-018	(שלב 2.1.7)
תחליף סרום נוקאאוט (KOSR)	תרמו-פישר	10828-028	20% ריכוז סופי (שלב 2.1.7)
חומצות אמינו לא חיוניות	תרמו-פישר	11140-035	(שלב 2.1.7)
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו-פישר	15140-122	ריכוז סופי של 50 U/mL (שלב 2.1.7)
L-גלוטמין 200 mM פתרון	תרמו-פישר	25030-081	ריכוז סופי של 2 mM (שלב 2.1.7)
β-מרקפטואתנול	תרמו-פישר	31350-010	ריכוז סופי של 50 מיקרומטר (שלב 2.1.7)
מדיום אינדוקציה נוירואפיתל מלא (NRI):
DMEM/F12	תרמו-פישר	3133-038	(שלב 2.3.1)
חומצות אמינו לא חיוניות	תרמו-פישר	11140-035	(שלב 2.3.1)
תוספת N2	תרמו-פישר	17502-048	(שלב 2.3.1)
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו-פישר	15140-122	ריכוז סופי של 50 U/mL (שלב 2.3.1)
הפרין דרגה I-A, ≥180 יחידות USP/מ"ג	סיגמא-אולדריץ'	H3149-100KU	ריכוז סופי של 2 מק"ג/מ"ל (שלב 2.3.1)
bFGF	תרמו-פישר	13256-029	20 נ"ג/מ"ל ריכוז סופי נוסף לפני השימוש (שלב 2.3.1)
מטריצת קרום מרתף מטריג'ל	קורנינג	354234	1:100 (שלב 2.2). מפשירים מטריג'ל על קרח, מכינים 200 אול אליציטוטים ומאחסנים אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. לציפוי, לדלל 200 ul aliquot ב 20 מ"ל של DMEM קר / F12 בינוני.
למינין	סיגמא-אולדריץ'	L2020	1:100 (שלב 2.2). לדלל ב-PBS 1X.
מדיום התמיינות עצבית מלא (ND):
מדיום נוירובזלי	תרמו-פישר	21103049	(שלב 2.4.11)
תוספי B-27 (50x)	תרמו-פישר	17504044	(שלב 2.4.11)
תוספת N2	תרמו-פישר	17502-048	(שלב 2.4.11)
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו-פישר	15140-122	ריכוז סופי של 50 U/mL (שלב 2.4.11)
GDNF	תרמו-פישר	PHC7045	1 נ"ג/מ"ל ריכוז סופי. יש להוסיף לפני השימוש. (שלב 2.4.11)
BDNF	תרמו-פישר	PHC7074	ריכוז סופי של 2.5 נ"ג/מ"ל. יש להוסיף לפני השימוש. (שלב 2.4.11)