כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. דיסוציאציה של תאי המוח התיכון הגחוני
- מעבירים את חתיכות המוח התיכון הגחוני מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית. הסר את תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS) והוסף 1 מ"ל מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) 0.05% חומצה טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטית (טריפסין-EDTA) לתוך הצינור החרוטי (נפח מספיק עבור עד 12 חתיכות של המוח התיכון הגחוני). לדגור על הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5-10 דקות.
- הסר טריפסין-EDTA מתחת למכסה המנוע והוסף 1 מ"ל מדיום de-activation (הסרום ינטרל טריפסין) לרקמה.
- הסר את מדיום ההשבתה ולשטוף את הרקמה ב 1 מ"ל של המדיום המלא פעמיים.
הערה: כדי למנוע השלכת התאים המנותקים, הימנעו מהוצאת כל המדיום מהצינור ומפיטום הרקמה.
- מוסיפים 1 מ"ל של מדיום מלא ו triturate את הרקמה עם פיפטה זכוכית מלוטשת אש. הימנע היווצרות בועות ולהמשיך triturating עד תרחיף תא יחיד מושגת.
הערה: בדרך כלל, 8-10 מעברים דרך הקצה המוגבל נדרשים לדיסוציאציה מלאה.
- צנטריפוגה את התאים ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהסיר את המדיום.
- השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל בינוני מלא על ידי pipeting איטי למעלה ולמטה עד ארבע פעמים.
2. ציפוי תאי המוח התיכון הגחוני
- מערבבים 10 μl של תרחיף התא עם 90 μl Trypan תמיסת כחול ולספור את מספר התאים עם hemocytometer.
הערה: ניתן לבדוק גם את הכדאיות של התאים בשלב זה.
- מניחים את פקקי צינור המיקרוצנטריפוגות המעוקרות בצלחות פטרי 100 מ"מ ומעבירים את הכיסויים המצופים Poly-L-ornithine/Laminin, באמצעות מלקחיים, אחד בכל פעם על גבי הכובעים.
הערה: אין לשטוף את הכיסויים ולהימנע מייבוש הלמינין, שכן הדבר עלול לגרום לתרביות לא אחידות ולהפחית את שרידות התאים.
- כוונן את הנפח ל- 1,500 תאים לכל 1 מיקרוליטר על ידי הוספת תווך שלם ו- 100 μl (סה"כ 150,000 תאים) של תרחיף התא מעל כל תלוש כיסוי (הנפח אופטימלי לכיסוי פני השטח של הכיסוי ללא שפיכה). סגרו את צלחות הפטרי ודגרו עליהן למשך שעה אחת באינקובטור תרבית רקמות לחות (37°C, 5% CO2).
הערה: שלב קריטי: שלב זה נדרש כדי לשפר את ההתקשרות ואת הכדאיות של התאים ולהגדיל את מספר הכיסויים לכל עובר. לחילופין, ניתן להעביר את התאים ישירות לבארות (המכילות כיסויים), אך יש להגדיל את מספר התאים ל-350,000 לבאר (במקום 150,000). במילים אחרות, בשיטה זו ניתן לרכוש 8-10 כיסויים, בעוד העברה ישירה מניבה כ-3-4 כיסויים בגלל התאים המתחברים לפלטות (ליד או מתחת לכיסויים). הכדאיות הממוצעת של התרבויות שהשתמשו בשיטה זו הייתה בסביבות 90%.
3. תרבות, צמיחה ותחזוקה
- לאחר שעה של דגירה, מעבירים בזהירות את הכיסויים, כולל המדיום, ללוחות 24 בארות המכילות 400 μl שחוממו מראש (עד 37 מעלות צלזיוס) תווך שלם (נפח כולל: 500 מיקרוליטר). לדגור על התאים למשך הלילה (O/N) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- בתוך 24 שעות לאחר הדגירה של הבארות, להוסיף בעדינות 500 μl מדיום שלם לתוך כל באר.
הערה: השעות הראשונות הן השלב הקריטי ביותר להישרדות הנוירונים הדופמינרגיים, ומספר התאים ששרדו אינו משתנה באופן משמעותי מעבר לנקודה זו.
- אין להוסיף מדיה נוספת לתרביות בשבועיים הראשונים או עד שהמדיום הופך לצהוב. אם תרבית במשך יותר משבועיים או שהצבע הבינוני משתנה לצהוב, החליפו מחצית מהמדיה (500 מיקרוליטר) במדיה טרייה ושלמה שחוממה מראש (בדרך כלל כל שבועיים).
הערה: נוירונים דופמינרגיים בתוך התרביות ישרדו יותר משישה שבועות בתנאים אלה.
