כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. קבלת דגימות רקמה
הערה: מרכיב קריטי בפרוטוקול זה מחייב טיפול נאות בתרומת הרקמה החל מרגע הנתיחה. כדאיות הדגימה הכוללת תלויה באופן משמעותי במזעור המרווח שלאחר המוות (PMI), העברה מיידית של הרקמה למדיום הקור המתאים בתוספת אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטיקה, שמירה על הדגימה על קרח רטוב לאורך כל ההובלה ושמירה על טכניקה סטרילית לאורך כל הפרוטוקול.
- עם ההודעה על תרומה קרובה, הכינו ערכת איסוף דוגמאות. שימוש בתיבת משלוח עם מכולה מבודדת שניתן להשתמש בה ישירות להובלה חוזרת של דגימת הרקמה, כלול את החומרים הבאים:
- כלול חומרים להכנת סטריל, כולל כפפות סטריליות, וילונות ואזמלים.
- כלול 8 - 10 צינורות חרוטי סטריליים 50 מ"ל המכילים 30 מ"ל אמצעי משלוח במיכל מבודד עם חבילות קרח או קר.
הערה: בעוד שכל מדיה סטנדרטית של תרביות תאים יכולה לעבוד, יכולת הקיום הטובה ביותר של הדגימה מתקבלת עם Hibernate-A בתוספת אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטי.
- כלול מבחנות דגימה נוספות עבור ניתוחים אחרים (למשל, קיבוע).
- אם הנתיחה לא תבוצע באתר החוקר, יש לצרף מסמך המציין בבירור כיצד לאסוף את דגימת הגידול. זה כולל פרטים כגון שמירה על סטריליות, שמירה על צינורות דגימה על קרח רטוב, וכולל דגימות מהמוח התיכון וממדולה כאשר תאי הגידול פולשים לעתים קרובות לאזורים אלה.
- יש לשמור על סטריליות במהלך הנתיחה שלאחר המוות. חשבו על המוח סטרילי בתוך הגולגולת, לכן שימו לב לטכניקה סטרילית (כולל החלפת כפפות) ברגע שהגולגולת פתוחה. הימנעות מזיהום בעור ובשיער היא קריטית.
- נתחו את הגידול מהצד הגחוני (ה"בטן" של הפונס, ראו איור 1). בעזרת אזמל סטרילי, חותכים גושים קטנים של 1 ס"מ מהגידול ומעבירים מיד לאמצעי משלוח קרים (ראה הערה בשלב 1.1.2) ומניחים קרח רטוב. מניחים 10 מ"ל של רקמה לתוך כל צינור, וכתוצאה מכך נפח סופי של רקמה ומדיה בכל צינור של 40 מ"ל.
הערה: במקרה של גליומה פונטין פנימית מפושטת (DIPG), הגידול חודר באופן מפוזר לפונס ולעתים קרובות לשאר גזע המוח. לכן, אספו כמה שיותר מהדגימה, בדרך כלל כולל 3 - 4 צינורות (30 - 40 מ"ל רקמה) מפונס ו 1 - 2 צינורות (10 - 20 מ"ל רקמה) כל אחד מהמוח התיכון ומדולה.
- אספו דגימות מהמוח התיכון ומהמדולה הסמוכות לפונס, שלעתים קרובות מכילות תאים סרטניים רבים.
- לאחר איסוף הדגימות, שלחו את הדגימות למשך הלילה (O/N) על קרח רטוב במיכל המבודד. אין לשלוח את הדגימה על קרח יבש, שכן הקפאה תהרוג את התאים.
2. הכנה לעיבוד דגימה
- לפני תחילת הכנת הדגימה, יש לעקר את קולטי האדים של תרביות הרקמה יחד עם סכיני גילוח, המוסטטים מעוקלים וכל כלי לא סטרילי אחר תחת אור אולטרה סגול (UV) למשך שעה אחת. בצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום של התרביות.
- הכינו פתרונות סינון סטריליים.
- להכנת תמיסת סוכרוז 1.8 מ ', ממיסים 308.07 גרם סוכרוז במים מזוקקים 300 מ"ל. הוסף 50 מ"ל 10x תמיסת מלח חוצצת של האנק (HBSS) ללא סידן או מגנזיום ותביא נפח כולל ל -500 מ"ל באמצעות מים מזוקקים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- להכנת תמיסת עיכול אנזימטית, יש ליטול 50 מ"ל HBSS עם סידן ומגנזיום לכל 10 מ"ל רקמה טחונה ולהוסיף 500 מיקרוליטר 5 מ"ג/מ"ל דאוקסיריבונוקלאז I (ריכוז סופי 50 מק"ג/מ"ל), 500 מיקרוליטר 2.5 מ"ג/מ"ל קולגנאז I/II ותמיסת דיספאס (ריכוז סופי 25 מק"ג/מ"ל), ו 500 μL 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) חוצץ. פתרון עיכול חם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- להכנת בסיס מדיה גזעית גידולית (TSM), ערבבו 250 מ"ל נוירובזל-A, 250 מ"ל מדיום עיט מעובד של דולבקו: תערובת חומרים מזינים F12 (DMEM/F12), 5 מ"ל 100x אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית, 5 מ"ל 200 מ"ל L-אלניל-L-גלוטמין דיפפטיד (GlutaMAX-A), 5 מ"ל חיץ HEPES, 5 מ"ל 100 מ"ל נתרן פירובט, ו-5 מ"ל 100x MEM חומצות אמינו לא חיוניות.
- כדי להכין TSM מלא עם גורמי גדילה, הוסף את התוספים הבאים לבסיס TSM: תוסף B27 פי 50 פחות ויטמין A (1:50), גורם גדילה אפידרמיס אנושי (H-EGF, 20 ננוגרם/מ"ל), גורם גדילה פיברובלסטים אנושי (H-FGF, 20 ננוגרם/מ"ל), גורם גדילה הנגזר מטסיות דם אנושיות AA (H-PDGF-AA, 10 ננוגרם/מ"ל), גורם גדילה הנגזר מטסיות דם אנושיות BB (H-PDGF-BB, 10 ננוגרם/מ"ל) ותמיסת הפרין (2 מיקרוגרם/מ"ל).
- Precool צנטריפוגת מעבדה המצוידת ברוטור דלי מתנדנד ל 4 ° C.
3. דיסוציאציה מכנית
- מעבירים את הרקמה לצלחת תרבית תאים בעלת דופן גבוהה בגודל 100 מ"מ x 20 מ"מ. הסר את שאריות המדיה מהמשלוח והחלף במדיה בתרבית קרה של 10 - 15 מ"ל.
- באמצעות hemostats מעוקל לתפוס סכין גילוח, לטחון את הרקמה דק תוך הסרת כלי דם ברורים או קרומי המוח.
הערה: שברי הרקמה הסופיים צריכים להיות קטנים מ-1 מ"מ (ראו איור 2B).
- מעבירים את הרקמה לצינור חרוטי נקי של 50 מ"ל. לשטוף את צלחת תרבית התא עם תוספת 5 מ"ל מדיה תרבית קרה ולהעביר צינור חרוט. חזור על שלב שטיפה זה לפי הצורך כדי להעביר את הרקמה שנותרה.
- באמצעות pipet סרולוגי 10 מ"ל, triturate בעדינות (4 - 5 פעמים). אפשרו לשברי רקמה גדולים יותר לשקוע לתחתית הצינור. במידת הצורך, צנטריפוגה קצרה את הדגימה במשך 1 דקות (350 x גרם, 4 ° C).
- אסוף את החלק המנותק מכנית.
- הסר את הסופרנאטנט וסנן אותו דרך מסנן של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל שכותרתו "דיסוציאציה מכנית". הפוך את המסנן מעל הצינור החרוטי המקורי ושטוף עם מדיה תרבית כדי לשחזר שברי רקמות.
- צנטריפוגה את החלק "דיסוציאציה מכנית" במשך 5 דקות (350 x גרם, 4 ° C).
- הסר את הסופרנאטנט מהמקטע "דיסוציאציה מכנית" הכדורי והשהה מחדש את הרקמה במדיה של תרבית קרה. אם יש יותר מ 5 מ"ל של רקמה בצינור החרוטי "דיסוציאציה מכנית", לפצל את הרקמה לצינורות חרוטי אחרים של 50 מ"ל כך שלאף צינור אין יותר מ -5 מ"ל רקמה.
- אחסנו את החלק המנותק מכנית על קרח עד לשלב הצנטריפוגה ההדרגתית של סוכרוז (שלב 5). לחלופין, המקטע המנותק מכנית יכול להמשיך לשלב 5 במהלך תקופת הדגירה של הדיסוציאציה האנזימטית (שלב 4.4).
4. דיסוציאציה אנזימטית
- אם יש יותר מ 5 מ"ל של רקמה בצינור המכיל את שברי הרקמה הגדולים הנותרים, לפצל את הרקמה לצינורות חרוטי חדשים אחרים של 50 מ"ל כך שלאף צינור אין יותר מ -5 מ"ל רקמה.
- צנטריפוגה את הצינורות החרוטיים המכילים את שברי הרקמה הנותרים למשך 5 דקות (350 x גרם, 4 ° C).
- מוציאים את הסופרנאטנט ומוסיפים את תמיסת העיכול האנזימטית המחוממת מראש, כך שיש תמיסת עיכול של 5 מ"ל לכל רקמה של 1 מ"ל (למשל, תמיסת עיכול של 25 מ"ל לכל רקמה של 5 מ"ל).
- אטמו את מכסי הצינור החרוטי בסרט מעבדה ודגרו על התגובה על מסובב בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
- לאחר הדגירה, שלשו את הדגימות בעדינות (ראו איור 2C).
- באמצעות pipet סרולוגי 10 מ"ל, pipet את הדגימה למעלה ולמטה 6 - 8 פעמים. הימנעו מיצירת בועות אוויר מוגזמות.
- מוסיפים קצה צינור של 1,000 מיקרוליטר לקצה הפיפט ומשלשלים 6-8 פעמים נוספות.
- הניחו לגושים הנותרים לשקוע לתחתית הצינור. הסר וסנן את הסופרנאטנט עם התאים שעדיין תלויים דרך מסנן של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל שכותרתו "דיסוציאציה אנזימטית" ואחסן על קרח.
- אם נותרו שברי רקמה משמעותיים, הוסיפו 10 מ"ל HBSS נוספים עם סידן ומגנזיום לשברים וחזרו על שלבים 3.5.1 ו-3.5.2. סנן תמיסה סופית זו דרך מסנן 100 מיקרומטר לתוך צינור "דיסוציאציה אנזימטית".
- צנטריפוגה את צינור "דיסוציאציה אנזימטית" במשך 5 דקות (350 x גרם, 4 ° C) ולהמשיך צנטריפוגה הדרגתית סוכרוז.
5. צנטריפוגת סוכרוז הדרגתית
- אם הדגימות עדיין מושעות בתמיסה, צנטריפוגה למשך 5 דקות (350 x גרם, 4 ° C).
- הסר את supernatant ו resuspend רקמה ב 20 מ"ל HBSS קר ללא סידן ומגנזיום. הביאו נפח של עד 25 מ"ל בסך הכל עם HBSS קר.
- מוסיפים באיטיות 25 מ"ל 1.8 מ' תמיסת סוכרוז והופכים את הצינור לערבוב. התוצאה היא שיפוע סוכרוז של 0.9 מ'.
- צנטריפוגה ללא בלימה למשך 10 דקות (800 x גרם, 4 ° C). שימוש בבלם צנטריפוגה ישבש את השיפוע ויפחית את התפוקה (ראו איור 2D לדוגמה של דגימה לפני ואחרי צנטריפוגה).
- בזהירות לשאוף פסולת מיאלין תמיסת סוכרוז רב ככל האפשר. שטפו את הדגימה על ידי הוספת HBSS קר 30 מ"ל ללא סידן ומגנזיום וערבוב עדין. צנטריפוגה למשך 5 דקות (350 x גרם, 4 ° C).
6. ליזה של תאי דם אדומים ACK
- מוציאים את הסופר-נטנט של הכביסה. הוסף 5 מ"ל ACK lysis buffer ובעדינות להשעות מחדש את גלולת התא, מערבל את הצינור במשך 1 דקות ב RT.
- להרוות את הליזיס על ידי הוספת HBSS קר 30 מ"ל ללא סידן ומגנזיום.
- צנטריפוגה למשך 5 דקות (350 x גרם, 4 ° C).
7. תחזוקת תרבות ראשונית
- להשהות מחדש את כדורי התא הסופיים ב 10 - 15 מ"ל חם להשלים TSM עם גורמי גדילה לכמת צפיפות תאים קיימא על hemocytometser באמצעות טריפאן כחול exclusion.
הערה: טווח התאים החיים משתנה במידה רבה בהתאם לנסיבות תרומת הרקמה, והכימות יכול להיות קשה בשלב מוקדם זה בגלל שאריות פסולת תאית. במקרה אידיאלי, שאפו שיהיו מיליון תאים חיים לדגימה. במקרים בהם נשארת פסולת עודפת, יש למרוח בצפיפות נמוכה יותר בצלוחית T175.
- העבר את מתלי התא הסופיים לצלוחית תרבית T75 חדשה. להוסיף גורמי גדילה נוספים כל יומיים כדי לשמור על רמות פקטורי הגדילה הכלליות ולעקוב אחר התפתחות נוירוספרות של תאי גידול (ראו איור 2E ואיור 3).
