התמיינות של תאי אב עצביים בחוט השדרה לנוירונים מוטוריים

תקציר

מקור: Taga, A. et al., הקמת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית למידול ALS עם אסטרוציטים ונוירונים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים אנושיים ספציפיים לאזור. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מציג שיטה להבחנה בין תאי אב עצביים של חוט השדרה (NPCs) לנוירונים מוטוריים. הוא מפרט את תהליך הטיפוח של NPCs על צלחת תרבית מצופה באמצעות מדיה מיוחדת המועשרת במעכבים ספציפיים שמטרתם להקל על התמיינות NPC לנוירונים מוטוריים בוגרים.

פרוטוקול

1. הפשרת תרביות תאי אב עצביים (NPC)

1. מצפים צלחות בקוטר 10 ס"מ בפוליאורניתין (אש"ף) ולמינין יום לפני הפשרת התאים.
   1. הוסף 5 מ"ל של אש"ף מדולל ל 100 מיקרוגרם / מ"ל במי מלח חוצצים פוספט (PBS) או מים מזוקקים (dH₂O) לצלחות. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה לפחות עד לילה.
   2. שאפו את תמיסת אש"ף ושטפו את הצלחות שלוש פעמים עם PBS. (אש"ף רעיל אם לא נשטף כראוי.)
   3. הוסיפו למינין מדולל ב-PBS לריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל ללוחות המצופים באש"ף. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת לפחות, רצוי למשך הלילה. לאחר הדגירה, יש לשאוף את תמיסת הלמינין ללא שטיפה כדי לשפר את הידבקות התא.
      הערה: את הצלחות ניתן לצפות באש"ף מבעוד מועד, לשטוף שלוש פעמים במים, לייבש במכסה מנוע סטרילי ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
2. הפשירו בקבוקון NPC אחד המכיל 6 x 10⁶ תאים/בקבוקון לכל צלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ.
3. הסר את צינור הקרינה NPC מחנקן נוזלי והנח אותו מיד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך עד 2 דקות. הפשיר במהירות על ידי ניעור הבקבוקון עד שיש חתיכת קרח קטנה מוקפת נוזל.
4. העבר אגרגטים של תאים לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות פיפטה של 1000 μL והוסף עד 15 מ"ל של מדיום התמיינות עצבית מחומם מראש (NDM) או של Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) / תוסף F21 F12 של Ham כדי לדלל את dimethyl sulfoxide (DMSO).
5. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
6. שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש את כדורית התא עם מדיום התמיינות של נוירון מוטורי (MN) (טבלה 1) + ROCK-I (20 מיקרומטר), והשתמשו בפיפט של 1000 מיקרוליטר כדי למחות מעלה ומטה עד לקבלת תרחיף תא בודד (עד 5 פעמים).
7. מעבירים את המתלה החד-תאי לצלחת מצופה אש"ף-למינין בקוטר 10 ס"מ.
8. מעבירים את הצלחת לאינקובטור ומשאירים אותה ללא הפרעה למשך הלילה כדי לאפשר היצמדות תקינה של התאים

2. הבחנה בין NPC חוט השדרה לנוירונים מוטוריים

1. בצע שלבים ראשוניים כאמור בשלבים 1.1-1.8, כאשר התווך הסופי הוא MN differentiation medium + ROCK-I (20 μM).
2. יום לאחר הציפוי, בצע החלפה מלאה של המדיום עם מדיום בידול MN ללא ROCK-I, ולאחר מכן שנה את המדיה כל יומיים. במהלך סוף השבוע, תאי הזנה ביום שישי ואז שוב ביום שני. שטפו את התאים עם PBS בעת הצורך כדי להסיר פסולת תאים.
3. שנה את התווך עם מדיום התמיינות MN + ציטוזין ארבינוזיד (ARA-C) (0.02 מיקרומטר) ודגור במשך 48 שעות כאשר אבות מחויבים גליה מופיעים כתאים שטוחים בודדים המתרבים תחת אבות MN פוסט-מיטוטיים המצטברים בצברי תאים.
   הערה: בדרך כלל, זה קורה בתוך 7 הימים הראשונים לאחר ציפוי ראשוני, אם כי ייתכן שיש שונות בהתאם לקו התא.
4. לאחר 48 שעות, שאפו את המדיום המכיל ARA-C, שטפו תרביות בעדינות עם PBS שלוש פעמים, והחליפו את המדיום למדיום MN טרי ללא ARA-C.
5. לאחר הטיפול ב- ARA-C, בצע החלפות בינוניות כל יומיים (או שני, רביעי ושישי) על ידי הסרת המדיום הישן עם פיפטה ידנית במקום שואב ואקום כדי למנוע ניתוק מוקדם מדי של אשכולות עצביים. בנוסף, להעשיר את המדיום MN עם Laminin 1 מיקרוגרם / מ"ל פעם בשבוע כדי לשפר עוד יותר את ההתקשרות העצבית ללוחות התרבית.

טבלה 1: מדיה תרבותית

שם בינוני	ריאגנטים	ריכוזים
מדיום התמיינות עצבית (NDM)	Neurobasal L-גלוטמין חומצות אמינו לא חיוניות תוספת N - תוספת N2 פניצילין/סטרפטומיצין	1x 100x 100x 100x פי 100
מדיום התמיינות נוירונים מוטוריים	התמיינות עצבית בינונית חומצה אסקורבית Puromorphamine גורם נוירוטרופי מוחי גורם נוירוטרופי ריסני גורם גדילה דמוי אינסולין 1 קו תאי גליה נגזר גורם נוירוטרופי חומצה רטינואית מתחם E מוסף ב' - תוסף B27	1x 0.4 מיקרוגרם/מ"ל<בר/> 1 μM 10 ננוגרם/מ"ל<בר/> 10 ננוגרם/מ"ל<בר/> 10 ננוגרם/מ"ל<בר/> 10 ננוגרם/מ"ל<בר/> 1 μM 125 nM פי 50

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות תרבית סטריליות בקוטר 10 ס"מ	בז	353003
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)	תרמופישר	11140050	ריכוז עבודה 100x
תוספת N - תוספת N2	תרמופישר	17502048	ריכוז עבודה 100x
ל-גלוטמין	תרמופישר	25030	ריכוז עבודה 100x
נוירובזל	תרמופישר	21103049	ריכוז עבודה 1x
חומצה רטינואית (RA)	סיגמא	₪625	יש להמיס 100 מ"ג ב-3.3 מ"ל DMSO לקבלת תמיסת מלאי של 100 מילימטר. Aliquot את המלאי 100 μL / צינור ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. קח 200 μL של 100 mM ציר ודלל 10x (להוסיף 1.8 מ"ל של DMSO) כדי ליצור 10 mM מלאי. Aliquot 50 μL / צינור ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. לדלל ב 1:10000 לשימוש. (ריכוז עבודה 2 מיקרומטר).
פוליאורניתין (אש"ף)	סיגמא-אולדריץ'	P3655	יש להמיס 100 מ"ג ב-1 מ"ל של ddW לקבלת תמיסת מלאי של 100 מ"ג/מ"ל. Aliquot את המניה בצינורות 100 μL. (ריכוז עבודה 100 מק"ג/מ"ל)
למינין	תרמופישר	23017-015	תמיסת מלאי 1 מ"ג/מ"ל, ריכוז עבודה 10 מיקרוגרם/מ"ל (ציפוי), 1 מיקרוגרם/מ"ל (חומרי הדפסה תאיים)
חומצה אסקורבית (ASAC)	סיגמא	A4403	יש להמיס 100 מ"ג ב-250 מ"ל של dH2O לקבלת 0.4 מ"ג/מ"ל במלאי. מסנן סטרילי דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, aliquot ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. לדלל ב 1:1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 0.4 מק"ג/מ"ל).
גורם נוירוטרופי ריסני (CNTF)	פפרוטק	450-13	יש להמיס 100 מיקרוגרם ב-1 מ"ל של PBS סטרילי, ולאחר מכן להוסיף 9 מ"ל של 0.1% BSA-PBS סטרילי ל-10 מיקרוגרם/מ"ל. Aliquot ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. לדלל ב 1: 1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 10 ננוגרם/מ"ל).
מתחם E	אבקאם	ab142164	יש להמיס 250 מיקרוגרם ב-2.0387 מ"ל DMSO לקבלת מלאי של 250 מיקרומטר. Aliquot ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. לדלל 1:2000 לשימוש. (ריכוז עבודה 125 ננומטר).
DMEM/F12	תרמופישר	113300	ריכוז עבודה 1x
נוירוטרופי שמקורו בקו תאי גליה (GDNF)	פפרוטק	450-10	יש להמיס 100 מיקרוגרם ב-1 מ"ל PBS ל-100 מיקרוגרם/מ"ל, ולאחר מכן להוסיף 9 מ"ל של 0.1% BSA-PBS סטרילי ל-10 מיקרוגרם/מ"ל. Aliquot ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. לדלל ב 1: 1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 10 ננוגרם/מ"ל).
מעכב ROCK-I	פפרוטק	1293823	להמיס 5 מ"ג ב 1480 μL של dH2O כדי לקבל 10 mM מלאי, aliquot ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. לדלל ב 1: 500 לשימוש. (ריכוז עבודה 20 מיקרומטר).
עפרון/סטרפטומיצין	תרמופישר	15140122	ריכוז עבודה 100x
פורמורפמין (PMN)	מיליפור-סיגמא	540223	יש להמיס 5 מ"ג ב-9.6 מ"ל DMSO לקבלת תמיסה של 1 מילימול. Aliquot ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. לדלל 1:1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 1 מיקרומטר).
גורם נוירוטרופי רקומביננטי אנושי-מוחי (BDNF)	פפרוטק	450-02	צנטריפוגה קצרה לפני ההרכבה מחדש. יש להמיס 100 מיקרוגרם ב-1 מ"ל PBS ל-100 מיקרוגרם/מ"ל, ולאחר מכן להוסיף 9 מ"ל של 0.1% BSA-PBS סטרילי ל-10 מיקרוגרם/מ"ל. Aliquot ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. לדלל ב 1: 1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 10 ננוגרם/מ"ל).
גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1)	מערכות מו"פ	291-G1-200	יש להמיס 200 מיקרוגרם ב-2 מ"ל PBS ל-100 מיקרוגרם/מ"ל, ולאחר מכן להוסיף 18 מ"ל של 0.1%BSA-PBS כדי ליצור מלאי של 10 מק"ג/מ"ל ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. עליקוט ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. לדלל 10 מיקרוגרם / מ"ל מלאי ב 1: 1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 10 ננוגרם/מ"ל).
נוירוטרופי שמקורו בקו תאי גליה (GDNF)	פפרוטק	450-10	יש להמיס 100 מיקרוגרם ב-1 מ"ל PBS ל-100 מיקרוגרם/מ"ל, ולאחר מכן להוסיף 9 מ"ל של 0.1% BSA-PBS סטרילי ל-10 מיקרוגרם/מ"ל. Aliquot ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. לדלל ב 1: 1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 10 ננוגרם/מ"ל).
חומצה רטינואית (RA)	סיגמא	₪625	יש להמיס 100 מ"ג ב-3.3 מ"ל DMSO לקבלת תמיסת מלאי של 100 מילימטר. Aliquot את המלאי 100 μL / צינור ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. קח 200 μL של 100 mM ציר ודלל 10x (להוסיף 1.8 מ"ל של DMSO) כדי ליצור 10 mM מלאי. Aliquot 50 μL / צינור ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. לדלל ב 1:10000 לשימוש. (ריכוז עבודה 2 מיקרומטר).
מתחם E	אבקאם	ab142164	יש להמיס 250 מיקרוגרם ב-2.0387 מ"ל DMSO לקבלת מלאי של 250 מיקרומטר. Aliquot ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. לדלל 1:2000 לשימוש. (ריכוז עבודה 125 ננומטר).
מוסף ב' - תוסף B27	תרמופישר	21985023	ריכוז עבודה 50x
ברדסים סטריליים לתרביות תאים	חברת בייקר	SG-600
צנטריפוגת תרבית תאים שולחנית	תרמופישר	75004261	Sorvall Legend X1R
אמבט מים	תרמופישר	2332	איזוטמפ
אינקובטור תרביות תאים מבוקר לחות	תרמופישר	370	מוגדר ל-37ºC, 5% CO2