בידוד וטיפוח אבות נוירונים גרעיניים של המוח הקטן מורין

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנות

1. הכנות לבידוד CGNP (אב נוירון גרעיני צרבלרי)
   1. ארגן הזדווגות מתאימה של עכברים כדי ליצור חיות P5-P7 כדי לבודד את המוח הקטן (3-5 חיות לכל ChIP ומצב).
   2. הכינו HBSS/גלוקוז על ידי הוספת 6 מ"ג/מ"ל גלוקוז למאגר HBSS.
   3. הכן את מדיום תרבית תאי CGNP (CGM) על ידי הוספת תוספת N2 של 1% (v/v), 1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין-נאומיצין, 25 mM KCl ו-10% FCS ל-DMEM-F12. לגידול CGNP, הכינו CGM בינוני ללא FCS אך כולל קיפוד קולי 0.6 מיקרוגרם/מ"ל (SHH) (CGM-SHH) ואזן אותו ל-37°C בעת הצורך.
   4. צפו צלחות תרבית תאים של 6 בארות בפולי-D-ליזין של 100 מיקרוגרם/מ"ל למשך 1-2 שעות ב-RT להסרת תאי גליה. לאחר מכן שטפו פעמיים עם ddH_{סטרילי 2}O ותנו לצלחות להתייבש. אחסנו את הצלחות למשך שבוע אחד לכל היותר בטמפרטורה של 4°C.
   5. לגידול CGNPs, מצפים צלחות תרבית תאים 6 בארות עם poly-L-ornithine (0.1 מ"ג / מ"ל) ב 4 ° C במשך הלילה. לאחר מכן, שטפו פעמיים עם H₂O לתרבית תאים ותנו לצלחות להתייבש.
      הערה: ניתן לאחסן את הצלחות למשך שבוע לכל היותר ב -4 מעלות צלזיוס.
   6. הכינו 0.025% טריפסין (w/v) ב-HBSS/גלוקוז ואזנו אותו ל-37°C בעת הצורך.
2. בידוד אב עצבי של רקמת המוח
   1. בידוד וטיפוח אופציונלי של CGNPs (אבות נוירונים גרגיריים צרבלריים)
      1. הרדימו בעלי חיים P5-7 על ידי עריפת ראש באמצעות מספריים. הסירו את עור הקרקפת, פתחו את הגולגולת והוציאו את המוח בעזרת מספריים קטנים ומלקחיים. בודדו את המוח הקטן והעבירו אותו לHBSS/גלוקוז קר כקרח. הסר את כל קרומי המוח וכלי הדם והעבר את הצרבלה לצינורות 15 מ"ל מלאים ב- HBSS / גלוקוז קר.
      2. לשטוף את cerebella שלוש פעמים עם 10 מ"ל קר כקרח HBSS/גלוקוז (לאסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C) הומוגניזציה צרבלה לאחר מכן על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה עם פיפטה 1 מ"ל (מקסימום 2-3 פעמים) כדי לקבל 0.5-1 מ"מ³ שברים.
      3. הוסף 5 מ"ל של 0.025% טריפסין ב- HBSS/גלוקוז ודגר על הרקמה תוך ערבוב מתמיד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. עצור את העיכול על ידי הוספת 5 מ"ל של CGM ואסוף את הרקמה בצנטריפוגה ב 650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
      4. הסר את supernatant ו triturate את הרקמה עם קצה צינור 1 מ"ל ב 1 מ"ל CGM ולהעביר אותו צינור חדש 15 מ"ל.
         הערה: חשוב להימנע מבועות אוויר.
         1. מוסיפים 5 מ"ל CGM ודגרים על התערובת במשך 2 דקות על קרח כדי ליישב שאריות רקמות. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש של 15 מ"ל. הוסף 2 מ"ל CGM לרקמה השיורית וחזור על הליך הטריטורציה.
      5. אגרו את הסופרנאטנטים (ללא שרידי רקמות, כ-10 מ"ל בסך הכל) ואת הצנטריפוגה ב-650 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את תאי המוח הקטן. להשעות את הגלולה ב 10 מ"ל CGM.
      6. מכיוון שאסטרוציטים נצמדים מהר יותר וחזק יותר לפולי-D-ליזין מאשר CGNPs, לוחים את התאים על לוחות 6-באר מצופים פולי-D-ליזין בגודל 100 מיקרוגרם/מ"ל (עד 4 מ"ל לבאר) ודגרים במשך 20 דקות ב-37°C כדי להסיר את האסטרוציטים.
      7. נערו את הצלחת ואספו את הסופרנטנט. ואז צנטריפוגה ב 650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C בצינור 15 מ"ל. להשהות מחדש את הגלולה ב 10 מ"ל CGM ולספור את התאים עם תא ספירה Neubauer.
         הערה: CGNPs הם עגולים, קטנים, ומראים הילה כאשר הם מצולמים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
      8. במידת הצורך, זרעו את התאים ב-CGM שחומם מראש בטמפרטורה של 37°C על צלחות מצופות פולי-L-אורניתין (3 x 10⁶ תאים לכל 6-באר) ודגרו עליהם בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ ו-100% לחות יחסית.
         הערה: השארת CGM על הלוחות (ועם זה FBS) תגרום להתמיינות של CGNPs לנוירונים גרגיריים צרבלריים (CGNs).