יצירת ספרואידים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

תקציר

מקור: Shaker, M. R., et al. דור חזק וניתן לשחזור של אורגנואידים במוח קליפת המוח למידול הזדקנות עצבית במוח במבחנה. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את הטרנספורמציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) לאורגנואידים כדוריים במוח. על ידי שימוש במעכבים ספציפיים, hPSCs מונחים להתמיין לקראת שושלת עצבית, ויוצרים מושבות נוירואקטודרמליות. לאחר מכן מוצגים גורמי גדילה מיוחדים, המעודדים ארגון עצמי והתפשטות של המושבות, מה שמוביל בסופו של דבר להיווצרות אורגנואידים כדוריים במוח.

פרוטוקול

1. יצירת אורגנואידים במוח קליפת המוח (איור 1)

הערה: כל השלבים בסעיף זה של הפרוטוקול יתרחשו במכסה מנוע בטיחות ביולוגית Class 2, אלא אם צוין אחרת.

1. השראת מושבות נוירואקטודרמליות דו-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) תרבית דו-ממדית (ימים -1 עד 3)
   1. לפני הזירוז, לוחה את מושבות hPSC על מטריצת קרום מרתף מוסמכת של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) בצלחת בעלת 6 בארות בצפיפות של 20%-30%. להשיג צפיפות זו על ידי העברת מושבות hPSC מבאר אחת של צלחת 6 בארות במפגש של 60% לשלוש בארות של צלחת 6 בארות.
   2. לציפוי מטריצת קרום מרתף, דללו את מטריצת קרום המרתף ביחס של 1:50 בתווך בסיסי רגיל. להפקיד באופן שווה 1 מ"ל / באר של צלחת 6 בארות, לדגור במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן לשאוף.
   3. יש לשמור על מושבות hPSC למשך יום אחד ב-2 מ"ל של מדיום תרבית תאים ללא סרום לפני ההתמיינות.
   4. ביום התמיינות hPSC, בדוק את מושבות hPSC באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה פי 4 עד פי 10 כדי להבטיח מושבות בריאות ללא התמיינות ניתנת לזיהוי.
      הערה: hPSCs בריאים ייצרו מושבות קצה הדוקות עם תאים בעלי גרעין גדול, ציטופלסמה קטנה מאוד וגרעינים בולטים. מושבות iPSC מובחנות יציגו הבדלים מורפולוגיים ברורים לאלה של מושבות hPSC המתוארות לעיל, במיוחד סביב הקצוות החיצוניים של המושבות או במרכז.
   5. הוסף ריאגנטים המפורטים בטבלה 1 כדי להשלים את מדיום N2 הדרוש לבידול. יש להביא מדיום זה ל-RT לפני השימוש.
   6. לאחר ההגעה ל-RT, שאפו את מדיום תרבית התאים נטול הסרום מכל באר של צלחת 6 הקידוחים והחליפו אותו ב-2 מ"ל של מדיום N2 שנוסף בעדינות עם פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל.
   7. הוסף את מדכא האימהות הכפול נגד מעכבי Decapentaplegic (SMAD), SB-431542 (10 μM) ו- LDN 193189 (100 nM).
      הערה: ניתן להוסיף את מעכבי SMAD למדיום N2 לאחר מיקום המדיום בכל באר או לכמות הנדרשת של מדיום N2 לפני החלפת מדיום תרבית התאים ללא סרום. ניתן לשלב מעכבים באופן שווה בתווך על ידי ערבול עדין של הצלחת או היפוך הצינור המכיל את המדיום והמעכבים 3-4 פעמים.
   8. הוסף מדיית N2 טרייה בתוספת SB-431542 (10 מיקרומטר) ו- LDN 193189 (100 ננומטר) מדי יום לכל באר במשך היומיים הבאים.
      הערה: מדיום N2 טרי מתווסף כדי להפחית את החשיפה הממושכת של תאים לדימתיל סולפוקסיד (DMSO) המשמש להמסת תרכובות SB-431542 ו- LDN 193189 ולמניעת ציטוטוקסיות.
2. יצירת ספרואידים נוירואקטודרמליים תלת-ממדיים ממושבות נוירואקטודרמליות דו-ממדיות מושרות (ימים 3 עד 7)
   1. הרימו את מושבות הנוירואקטודרמיס המושרות באמצעות דיספאס לפי השלבים הבאים 1.2.2-1.2.8.
   2. ראשית, הסר 2 מ"ל של מדיום N2 מהצלחת בעלת 6 הקידוחים, ושטוף 1x עם HBSS כדי להבטיח שכל מדיום N2 יוסר.
      הערה: מדיום N2 יכול להפריע לפעילות האנזים של dispase, ולמנוע ניתוק נאות של מושבות neuroectodermal מן הבאר.
   3. יש להוסיף 1 מ"ל של 2.4 יחידה/מ"ל דיספס לכל באר המכילה מושבה.
   4. לדגור על הבאר במשך 20-25 דקות (מקסימום 30 דקות) ב 37 ° C. בדוק ניתוק מושבה באופן קבוע.
      הערה: מושבות קטנות יכולות להתנתק תוך 20 דקות. יש להתעלם מכל מושבה שנשארת תקועה לאחר 30 דקות.
   5. לאחר הדגירה, יש להוסיף 1 מ"ל של מדיום N2 לבאר כדי לעצור את פעילות אנזים הדיפאס ולהעביר את המושבות לצינור של 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה P1000 רחב או קצה פיפטה P1000 שונה החתוך במספריים סטריליים (מה שהופך אותו לקצה P1000 רחב משעמם).
   6. לאפשר לגושי המושבה לשקוע לתחתית הצינור עם כוח הכבידה.
      הערה: תהליך זה ייקח כדקה.
   7. לאחר שהגושים שקעו, הסירו בזהירות את הסופרנאטנט עם קצה פיפטה P1000 סטנדרטי והחליפו אותו ב-1 מ"ל של מדיום N2 טרי. חזור על שלב כביסה זה שלוש פעמים כדי להבטיח הסרה מלאה של dispase.
      הערה: כל דיספאס שנותר ימנע היווצרות אחידה של ספרואידים נוירואקטודרמליים ויגרום למוות תאי.
   8. לאחר השטיפה, יש להשהות מחדש את גושי התאים ב-3 מ"ל של תווך N2, להעביר לבאר אחת של צלחת בעלת 6 בארות, ולהוסיף 40 ננוגרם/מ"ל של גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF).
      הערה: אם מספר גבוה של מושבות נוירואקטודרמליות היו מנותקות, מושבות אלה היו יכולות להיות מצופות על פני שתי בארות או יותר של צלחת בת 6 בארות כדי למנוע איחוי ספרואידים. 24 שעות לאחר ניתוק המושבות, בדקו אם נוצרו הספרואידים.
   9. שמור על הספרואידים באותה מדיה במשך 3-4 הימים הבאים, אך הוסף bFGF טרי (40 ננוגרם/מ"ל) לכל באר מדי יום כדי לקדם התפשטות תאים נוירואקטודרמליים, ארגון עצמי, ולגרום ולהרחיב neuroepithelia.
      הערה: אם הספרואידים צופו בצפיפות גבוהה יותר, סביר להניח שהמדיה תהפוך לצהובה ותדרוש החלפה כל יומיים ב-bFGF טרי (40 ננוגרם/מ"ל). עם זאת, זה לא מומלץ, ובמקום זאת, מספר נמוך יותר של spheroids צריך להישמר בכל באר כדי למנוע בעיה זו. ספרואידים יכולים להיות מוטמעים במטריצת קרום המרתף לאחר 3 ימים אם נוירואפיתליה ניכרים. אם neuroepithelia אינם ניכרים או לא נראים חזקים, ואז לשמור על spheroids ליום נוסף לבדוק שוב.

טבלה 1: N2 בינוני. הטבלה מפרטת את הריאגנטים הדרושים להכנת מדיום N2.

רכיבי מדיה	ריכוז
תערובת חומרים מזינים DMEM F12 10x 500 מ"ל (DMEM/F-12)
תוסף N2 5 מ"ל (100x)	מסופק ב-1%
תוספת B 27 10 מ"ל	תוספת בשיעור של 2%
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (100x)	תוספת של 1%
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	תוספת של 1%
2-מרקפטואתנול 50 מ"ל (1000x )	תוספת ב 0.1%

תוצאות

איור 1: דיאגרמה סכמטית ליצירת אורגנואידים במוח קליפת המוח הניתנים לשחזור. זרימת עבודה סכמטית של ההליך הניסיוני ליצירת אורגנואידים במוח קליפת המוח מ- hPSCs המתוחזקים בתווך ללא מזין. זרימת העבודה מספקת סקירה כללית של שישה שלבים המעורבים בהבחנה בין hPSCs דו-ממדיים לרקמות אנושיות של לוחות קליפת המוח בתבנית תלת-ממדית באורגנואידים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
16% פורמלדהיד (W/V) ללא מתנול	תרמו פישר סיינטיפיק	28908	4% מה-PFA מדוללים ב-1x PBS
2-מרקפטואתנול 50 מ"ל (1000x)	לייף טכנולוגיות אוסטרליה (TFS)	21985023	משמש במדיית NM ו- DM
תוספת B 27 10 מ"ל	לייף טכנולוגיות אוסטרליה (TFS)	17504044	משמש במדיית NM ו- DM
מיקרוסקופ CKX53 עם מצלמת SC50	אולימפוס
קורנינג קוסטאר 6 צלחות תרבית תאים	סיגמא Aldrich Pty בע מ	CLS3516-50EA
אבקת Dispase II	תרמו פישר סיינטיפיק	17105041	האבקה מומסת ב-HBSS, מסוננת דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, אליציטוט ב-10 מ"ל ומאחסנת ב-20°C
תערובת חומרים מזינים DMEM F12 10x 500 מ"ל (DMEM/F-12)	תרמופישר	11320082	משמש במדיית NM ו- DM
DMSO דימתיל סולפוקסיד	סיגמא Aldrich Pty בע מ	D2650-100ML
פוספט של דולבקו חוצץ מלוחים	סיגמא Aldrich Pty בע מ	D1408-500ML
Falcon Matrigel hESC מוסמך Matrix	In Vitro טכנולוגיות Pty בע מ	FAL354277	הפוך aliquotes של 100 μL ומאוחסן ב -20 °C
תוסף GlutaMAX 100x	תרמו פישר סיינטיפיק	35050061	משמש במדיית NM ו- DM
הנקס תמיסת מלח מאוזנת	סיגמא Aldrich Pty בע מ	H8264
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (EU79)			רפורוגרמה פנימית מפיברובלסט עור
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (G22)	Genea Biocells		מתקבל מ Genea Biocells (סן דייגו, ארצות הברית)
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (WTC)			מתנת פרופסור ברוס קונקלין
InSolution TGF-Β RI Kinase Inhibitor VI, SB431542	מרק	US1616464-5 מ"ג
תמיסת אינסולין רקומביננטי אנושי	סיגמא Aldrich Pty בע מ	I9278	משמש במדיית NM ו- DM
LDN193189 דיהידרוכלוריד	סיגמא Aldrich Pty בע מ	SML0559-5 מ"ג	משמש במהלך בידול
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (100x)	תרמו פישר סיינטיפיק	11140050	משמש במדיית NM ו- DM
mTeSR פלוס	טכנולוגיות STEMCELL	100-0276	משמש לשמירה על מושבות hiPSC לפני בידול עם מדיה NM
תוסף N2 5 מ"ל (100x)	Life טכנולוגיות אוסטרליה Pty בע מ	17502048	משמש במדיית NM ו- DM
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	תרמו פישר סיינטיפיק	15140122	משמש במדיית NM ו- DM
רקומביננטי אנושי FGF בסיסי	מערכות מו"פ	233-FB-01M	Aliquots מיוצרים ב 20 מיקרוגרם / מ"ל ומאוחסנים ב -20 ° C
SB431542	טוקריס	1614	משמש במהלך בידול
צלחות מרובות חיבור אולטרה נמוכות, צלחת 24 בארות, פוליסטירן	סיגמא Aldrich Pty בע מ	CLS3473-24EA