יצירת ספרואידים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

תקציר

מקור: Shaker, M. R., et al. דור חזק וניתן לשחזור של אורגנואידים במוח קליפת המוח למידול הזדקנות עצבית במוח במבחנה. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את הטרנספורמציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) לאורגנואידים כדוריים במוח. על ידי שימוש במעכבים ספציפיים, hPSCs מונחים להתמיין לקראת שושלת עצבית, ויוצרים מושבות נוירואקטודרמליות. לאחר מכן מוצגים גורמי גדילה מיוחדים, המעודדים ארגון עצמי והתפשטות של המושבות, מה שמוביל בסופו של דבר להיווצרות אורגנואידים כדוריים במוח.

פרוטוקול

1. יצירת אורגנואידים במוח קליפת המוח (איור 1)

הערה: כל השלבים בסעיף זה של הפרוטוקול יתרחשו במכסה מנוע בטיחות ביולוגית Class 2, אלא אם צוין אחרת.

1. השראת מושבות נוירואקטודרמליות דו-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) תרבית דו-ממדית (ימים -1 עד 3)
   1. לפני הזירוז, לוחה את מושבות hPSC על מטריצת קרום מרתף מוסמכת של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) בצלחת בעלת 6 בארות בצפיפות של 20%-30%. להשיג צפיפות זו על ידי העברת מושבות hPSC מבאר אחת של צלחת 6 בארות במפגש של 60% לשלוש בארות של צלחת 6 בארות.
   2. לציפוי מטריצת קרום מרתף, דללו את מטריצת קרום המרתף ביחס של 1:50 בת....

תוצאות

איור 1: דיאגרמה סכמטית ליצירת אורגנואידים במוח קליפת המוח הניתנים לשחזור. זרימת עבודה סכמטית של ההליך הניסיוני ליצירת אורגנואידים במוח קליפת המוח מ- hPSCs המתוחזקים בתווך ללא מזין. זרימת העבודה מספקת סקירה כללית של שישה שלבים המעורבים בהבחנה בין hPSCs דו-ממדיים לרקמות אנושיות של לוחות קליפת המוח בתבנית תלת-ממדית באורגנואידים.

....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
16% פורמלדהיד (W/V) ללא מתנול	תרמו פישר סיינטיפיק	28908	4% מה-PFA מדוללים ב-1x PBS
2-מרקפטואתנול 50 מ"ל (1000x)	לייף טכנולוגיות אוסטרליה (TFS)	21985023	משמש במדיית NM ו- DM
תוספת B 27 10 מ"ל	לייף טכנולוגיות אוסטרליה (TFS)	17504044	משמש במדיית NM ו- DM
מיקרוסקופ CKX53 עם מצלמת SC50	אולימפוס
קורנינג קוסטאר 6 צלחות תרבית תאים	סיגמא Aldrich Pty בע מ	CLS3516-50EA
אבקת Dispase II	תרמו פישר סיינטיפיק	17105041	האבקה מומסת ב-HBSS, מסוננת דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, אליציטוט ב-10 מ"ל ומאחסנת ב-20°C
תערובת חומרים מזינים DMEM F12 10x 500 מ"ל (DMEM/F-12)	תרמופישר	11320082	משמש במדיית NM ו- DM
DMSO דימתיל סולפוקסיד	סיגמא Aldrich Pty בע מ	D2650-100ML
פוספט של דולבקו חוצץ מלוחים	סיגמא Aldrich Pty בע מ	D1408-500ML
Falcon Matrigel hESC מוסמך Matrix	In Vitro טכנולוגיות Pty בע מ	FAL354277	הפוך aliquotes של 100 μL ומאוחסן ב -20 °C
תוסף GlutaMAX 100x	תרמו פישר סיינטיפיק	35050061	משמש במדיית NM ו- DM
הנקס תמיסת מלח מאוזנת	סיגמא Aldrich Pty בע מ	H8264
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (EU79)			רפורוגרמה פנימית מפיברובלסט עור
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (G22)	Genea Biocells		מתקבל מ Genea Biocells (סן דייגו, ארצות הברית)
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (WTC)			מתנת פרופסור ברוס קונקלין
InSolution TGF-Β RI Kinase Inhibitor VI, SB431542	מרק	US1616464-5 מ"ג
תמיסת אינסולין רקומביננטי אנושי	סיגמא Aldrich Pty בע מ	I9278	משמש במדיית NM ו- DM
LDN193189 דיהידרוכלוריד	סיגמא Aldrich Pty בע מ	SML0559-5 מ"ג	משמש במהלך בידול
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (100x)	תרמו פישר סיינטיפיק	11140050	משמש במדיית NM ו- DM
mTeSR פלוס	טכנולוגיות STEMCELL	100-0276	משמש לשמירה על מושבות hiPSC לפני בידול עם מדיה NM
תוסף N2 5 מ"ל (100x)	Life טכנולוגיות אוסטרליה Pty בע מ	17502048	משמש במדיית NM ו- DM
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	תרמו פישר סיינטיפיק	15140122	משמש במדיית NM ו- DM
רקומביננטי אנושי FGF בסיסי	מערכות מו"פ	233-FB-01M	Aliquots מיוצרים ב 20 מיקרוגרם / מ"ל ומאוחסנים ב -20 ° C
SB431542	טוקריס	1614	משמש במהלך בידול
צלחות מרובות חיבור אולטרה נמוכות, צלחת 24 בארות, פוליסטירן	סיגמא Aldrich Pty בע מ	CLS3473-24EA