$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת חומר דיסקציה, מדיה תרבותית, התקנים מיקרופלואידים
- מלקחיים מיקרו-דיסקציה ומספריים אוטוקלאביים (121 מעלות צלזיוס, זמן עיקור: 20 דקות) ואחסנו אותם במיכל סטרילי.
- יש לעקר כיסויי זכוכית (24 מ"מ x 24 מ"מ) על ידי דגירה שלהם ב-1 M HCl למשך 24 שעות על שייקר אורביטלי ב-37°C. לשטוף אותם שלוש פעמים עם H2O סטרילי ומזוקק שלוש פעמים עם אתנול 99%. לאחר מכן יבשו את הכיסויים בטמפרטורה של 37°C או מתחת למכסה מנוע סטרילי. לבסוף, autoclave או לחשוף את coverslips לאור UV (30 דקות) כדי להשלים את העיקור. לאחר מכן ניתן לאחסן את הכיסויים באתנול 70%.
- באמצעות מלקחיים סטריליים, הסר בזהירות את מכשירי הבידוד AXIS Axon מהאריזה והניחו אותם בצלחת פטרי סטרילית.
- באמצעות ניקוב ביופסיה סטרילי (ø: 1mm) ליצור חור אחד לכל דגימה לתרבית (איור 1) בהתאמה של תאי התרבית.
הערה: אין להכות קרוב מדי microgrooves, כפי שהם עלולים להיפגע על ידי הלחץ שהופעל.
- לעקר את התקני בידוד אקסון AXIS על ידי טבילתם באתנול 70%. לאחר מכן יבש את התקני בידוד אקסון AXIS ומכסה לחלוטין מתחת למכסה מנוע זרימה סטרילי. המתן לפחות 3 שעות לפני שתמשיך.
הערה: ייבוש לא שלם יגרום להרכבה פגומה של המכשירים המיקרופלואידים.
- מניחים כל כיסוי בכלי פטרי בקוטר 35 מ"מ או בבאר בתוך צלחת בעלת 6 בארות.
- הניחו את התקן הבידוד AXIS Axon על הכיסוי ולחצו בעדינות אך בחוזקה עם מלקחיים עם קצוות מכופפים כדי לאפשר הדבקה מלאה בין התקן הבידוד לכיסוי הזכוכית.
- בכל תא תרבית, פיפטה 150 μl של פולי-D-ליזין (0.1 מ"ג/מ"ל ב H2O סטרילי ומזוקק). הניחו את המכשירים המיקרופלואידים תחת ואקום למשך 5 דקות, כדי להוציא את כל האוויר מתאי התרבית.
- אם עדיין ניתן לראות אוויר בתוך התאים, יש להכניס מחדש את תמיסת הפולי-D-ליזין לתאים.
- לדגור על המכשירים עם poly-D-lysine O/N ב 37 ° C.
- יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם H2O סטרילי ומזוקק.
- יש למלא תאים בתמיסת עבודה של למינין 150 μl (Sigma-Aldrich, 5 מיקרוגרם/מ"ל, במי מלח חוצצי פוספט (PBS) או בתווך נטול סרום), ולדגור O/N ב-37°C.
- הכן 50 מ"ל של בינוני עבור תרביות גרעינים trigeminal עם ההרכב הבא: 48 מ"ל Neurobasal בינוני, 1 מ"ל B-27, 100 U/ml פניצילין/סטרפטומיצין, 2 mM L-גלוטמין, 5 ng / ml גורם גדילה עצבי (NGF), 0.25 pM ציטוזין arabinoside.
- הכינו 50 מ"ל מדיום לתרביות נבט שיניים בהרכב הבא: 40 מ"ל Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)-F12, 10 מ"ל סרום בקר עוברי (FBS, ריכוז סופי: 20%), 100 U/ml פניצילין/סטרפטומיצין, 2 mM L-גלוטמין, 150 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית.
2. יצירת עוברי עכבר ונתיחתם
- לקבוע את גיל העובר על סמך תקע הנרתיק (פקק בנרתיק: יום התפתחות עוברי 0.5, E0.5) ולאשר אותו באמצעות קריטריונים מורפולוגיים. עבור פרוטוקול זה, אנו משתמשים בדרך כלל בעוברי עכבר E14.5-E17.5.
- נקו את אזור הדיסקציה ואת הסטריאוסקופ עם אתנול 70%.
- להקריב את האם ההרה באמצעות נקע צוואר הרחם. מקם את צוואר העכבר בין האצבע הראשונה והשנייה על רשת, ומשוך בהחלטיות את הזנב.
- מנתחים את העור סביב הבטן התחתונה ופותחים את הבטן בעזרת מספריים. אתר את הרחם: בשלבים המאוחרים של ההריון, הרחם ממלא בשפע את חלל הבטן.
- נתחו את הרחם והניחו אותו בצינור מלא PBS על קרח. כאשר על קרח, הרקמה ניתן להשאיר במשך מספר שעות. להשליך את גופת האם על פי הנחיות מוסדיות.
- לנתח את העוברים מהרחם ולשחרר אותם מהרקמות החוץ-עובריות שלהם. הניחו את העוברים ב-PBS על קרח.
- ערפו את ראשיהם של העוברים באמצעות מספריים והפרידו את הלסת התחתונה משאר הראש באמצעות מספריים מיקרו-דיסקציה (איור 2A). הסר את הלסת התחתונה במדויק, מבלי לפגוע בגרעינים הטריגמינליים; מכיוון שהאחרונים ממוקמים בסמיכות ללסת התחתונה, הנזק המקרי שלהם אפשרי. שמרו על הלסת התחתונה ושאר הראש ב-PBS קר, על קרח.
- כדי לנתח גרעינים טריגמינליים (TG), קחו את הראש והניחו אותו על צלחת פטרי מזכוכית דיסקציה, שהייתה מלאה בעבר ב-PBS קר. בעזרת המלקחיים, להסיר את העור ואת הגולגולת. לאחר מכן להסיר את telencephalon ואת המוח הקטן על ידי הצבת מלקחיים מתחת telencephalon להרים; הטלנספלון והמוח הקטן יתהפכו יחד, ויותירו את תחתית הגולגולת חשופה.
- מקמו את הגרעינים הטריגמינליים (איור 2B). השתמש במלקחיים כדי להפריד את TG מן העצבים trigeminal. סלקו את שאריות ההקרנות הטריגמינליות באמצעות מחטי הדיסקציה כסכינים. הניחו את ה-TG המנותח בצלוחית פטרי מלאה ב-PBS קר ושמרו אותם על קרח.
- כדי לנתח שיניים עובריות, הניחו את הלסת התחתונה, שהופרדה בעבר מהגולגולת, על צלחת פטרי מזכוכית דיסקציה, מלאה ב-PBS קר. באמצעות מחטי דיסקציה כסכינים, להסיר את הלשון ואת העור סביב הלסת. הפרד את הלסת השמאלית והימנית על ידי חיתוך לאורך קו האמצע של הלסת. חיידקי השיניים נראים בקלות, כפי שמוצג באיור 2C. בודדו את חיידקי השן באמצעות מחטי דיסקציה והוציאו עודפי רקמות שאינן דנטליות. הניחו את חיידקי השיניים המנותחים בצלוחית פטרי מלאה ב-PBS קר ושמרו אותם על קרח.
3. תרביות מיקרופלואידיות
- לאחר דיסקציה, להסיר laminin מן המכשירים microfluidic. מלא את התאים עם 200 μl של המדיה בהתאמה.
- בעזרת מלקחיים, העבירו בעדינות את חיידקי ה-TG והשיניים שנותחו לתוך החורים שנוצרו על-ידי ניקוב (איור 2D). יש לוודא שחיידקי השיניים אינם צפים ושהם שוקעים עד שהם באים במגע עם הכיסויים.
- תרבית את הדגימות באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO2.
- שנה את מדיום התרבות כל 48 שעות. אין לרוקן את התאים לחלוטין, ואין לזרום ישירות לתאי התרבות.
ריקון מוחלט של התאים יגרום להיווצרות בועות אוויר בתוך החדרים; צנרת ישירה לתוך התא תגרום לנזק אקסונלי. כדי למנוע בעיות אלה, להסיר את המדיום מכוון פיפטה לכיוון הצד החיצוני של הבארות; באופן דומה, פיפטה המדיום הטרי בצד הבארות הממוקם מול החדרים.
- ניתן לצלם בקלות תרביות משותפות באמצעות מיקרוסקופ בהילוך מהיר במהלך תקופת התרבית וניתן לשמור עליהן במשך למעלה מ-10 ימים.
- לאחר תקופת התרבית, שטפו את התאים על ידי הזרמה של 150 מיקרוליטר PBS לבאר אחת לכל חדר, ותנו ל-PBS לזרום דרך התאים שלוש פעמים.
- הסר את PBS ותקן את הדגימות על ידי pipeting 150 μl של paraformaldehyde 4% (ב PBS) בבאר אחת לכל חדר; לדגור ב RT במשך 15 דקות. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS כמתואר 3.6.
- המשך בניתוח נוסף.
