$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
הערה: איור 1A, B מראה סכמה של שבב קופולימר אולפין מחזורי (COC) שהורכב מראש, כולל המיקומים של התעלות או התאים הראשיים, הבארות והמיקרו-חריצים. השבב הממודר יכול ליצור מיקרו-סביבות נוזליות נפרדות בתוך התא, כפי שמודגם על-ידי בידוד צבעי מאכל (איור 1C).
1. ציפוי של שבבים מרובי תאים עבור נוירונים hSC
הערה: איור 2A מציג סקירה כללית של הליכי הציפוי.
- להמיס פולי-L-אורניתין במים מזוקקים ברמת תרבית תאים כדי לייצר תמיסה של 600 מיקרוליטר לכל שבב של תמיסת עבודה של 20 מיקרוגרם/מ"ל.
- שאפו את שארית המלח האגירה בפוספט (PBS) שנותרה לאחר הכנת השבבים מהבארות. בעת השאיפה, ודא שקצה הצינור רחוק מפתח הערוץ.
הערה: התעלות המיקרופלואידיות חייבות להישאר מלאות במשך כל הליך זה. אין לשאוב נוזלים מהתעלות/תאים, אלא רק מהבארות.
- עומס 150 μL של פתרון עבודה poly-L-ornithine בפינה הימנית העליונה. המתן 90 שניות או עד שהנוזל מתחיל למלא היטב את החלק הימני התחתון. הוסף 150 μL של מדיה לפינה הימנית התחתונה היטב והמתן 5 דקות כדי לתת לנוזל לעבור דרך microgrooves.
- הוסף 150 μL של מדיה בפינה השמאלית העליונה היטב. המתן 90 שניות ולאחר מכן הוסף 150 μL לשמאל התחתון היטב. לעטוף את מחזיק השבב(ים) עם parafilm ומניחים ב 4 ° C למשך הלילה.
הערה: לחלופין, מקם את השבב והמחזיק בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
- שאפו את התקשורת מהבארות, וודאו שקצה הצינור ממוקם הרחק מפתח התעלה. הוסף 150 μL של מים סטריליים לבאר הימנית העליונה. המתן 90 שניות ולאחר מכן הוסף 150 μL לימין התחתון היטב. המתן 5 דקות כדי לתת לנוזל לעבור דרך המיקרו-חריצים.
- הוסף 150 μL של מים סטריליים לבאר השמאלית העליונה, לחכות 90 שניות, ולאחר מכן להוסיף עוד 150 μL לבאר השמאלית התחתונה.
- חזור על שלבים 1.5-1.6.
- הפשירו למינין באיטיות ב-2°C עד 8°C והכינו תמיסת עבודה של 10 מיקרוגרם/מ"ל.
- עומס 150 μL של פתרון עבודה למינין לבאר הימנית העליונה. המתן 90 שניות או עד שהנוזל מתחיל למלא היטב את החלק הימני התחתון. Pipet 150 μL לבאר הימנית התחתונה. המתן 5 דקות כדי לתת ללמינין לעבור דרך המיקרו-חריצים.
- הוסף 150 μL של למינין לשמאל העליון היטב. המתן 90 שניות ולאחר מכן הוסף 150 μL לשמאל התחתון היטב. לדגור את השבב בתוך המחזיק שלו במשך 2 שעות ב 37 ° C.
- שטפו את השבב עם PBS (ללא Ca2+ ו-Mg2+). עומס 150 μL של PBS לפינה הימנית העליונה היטב. המתן 90 שניות או עד שהנוזל מתחיל למלא היטב את החלק הימני התחתון. הוסף 150 μL של PBS לבאר הימנית התחתונה והמתן 5 דקות כדי לאפשר ל- PBS לעבור דרך המיקרו-חריצים.
- Pipet 150 μL של PBS לבאר השמאלית העליונה. לאחר 90 שניות צינור 150 μL לבאר השמאלית התחתונה.
- שאפו PBS מהשבב ולאחר מכן שטפו את השבב במדיה של NSC (ראו טבלת חומרים). טען 150 μL של מדיה לימין העליון היטב. לאחר 90 שניות או כאשר נוזל עובר דרך התעלה הימנית לתוך הבאר הימנית התחתונה, להוסיף 150 μL לבאר הימנית התחתונה. המתן 5 דקות כדי לאפשר למדיה לזרום דרך המיקרו-חריצים.
- הוסף 150 μL של מדיה לבאר השמאלית העליונה ועוד 150 μL לבאר השמאלית התחתונה. לדגור על השבב באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 כדי להתנות מראש את השבב עד שיהיה מוכן לזרע NSCs.
הערה: ניתן להתנות את הצ'יפס מראש למשך הלילה במידת הצורך.
2. זריעת NSCs לתוך השבב הרב-תאי
הערה: פרוטוקול זה השתמש בתאי גזע עובריים שנרכשו באופן מסחרי, בניגוד לפרסום הקודם שלנו שהחל בתאי גזע עובריים אנושיים. בפרוטוקול זה, תאי גזע עצביים מצופים ישירות לתוך שבבי הפלסטיק, שם הם מתמיינים לנוירונים. ניתן לאפשר לתאים להתרבות כתאי גזע גזעיים (ללא התמיינות) למשך עד 2 מעברים ולאחסן אותם בבקבוקונים בנוזל N2 לשימוש נוסף. פרוטוקול זה משתמש בבקבוקוני NSC המאוחסנים בנוזל N2 לאחר מעבר 1 או 2. איור 2B מציג סקירה כללית של הליכי הציפוי.
- הפשרת NSCs בהתאם להוראות היצרן.
הערה: הליך זה חל על NSCs הנגזרים מ- H9. קווי תאים אחרים ידרשו אופטימיזציה של צפיפות התא.
- ספור את ריכוז התא באמצעות המוציטומטר והתאם באמצעות מדיה NSC כדי לקבל ריכוז של 7 x 106 תאים למ"ל.
- שאפו מדיה מכל באר של השבב. הימנע משאיפת מדיה מהערוצים העיקריים.
- Pipet 5 μL של תמיסת התא לבאר הימנית העליונה, ואחריו 5 μL לבאר הימנית התחתונה (70,000 תאים בסך הכל). ודא כי התאים הם pipeted לכיוון פתחי התעלה הראשי. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק שתאים נכנסו לערוץ. המתן 5 דקות עד שהתאים ייצמדו לחלק התחתון של השבב.
הערה: ניתן להשתמש באחד התאים או בשניהם כדי לטעון תאים.
- Pipet ~ 150 μL של מדיה NSC לבאר הימנית העליונה ולאחר מכן 150 μL לבאר הימנית התחתונה. חזור על הפעולה בצד שמאל. יש לדגור ב-5% CO2, 37°C בתוך מיכל לח מתאים.
- לאחר 48 שעות, שאפו מדיית NSC מהבארות והחליפו אותה במדיית התמיינות עצבית על ידי הוספת 150 μL לכל באר עליונה ולכל באר תחתונה.
- תאי עצב בתרבית בתוך אינקובטור 5% CO2, 37 °C בתוך מיכל לח מתאים.
