$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת פתרונות
- הכינו תמיסת דיסוציאציה של רקמות העשויה מפנול סטרילי אדום המכיל מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco עם פפאין (100 U/ml), ציסטאין (0.2 מ"ג/מ"ל) ו-deoxyribonuclease (DNase, 250 U/ml).
- כדי להכין את הפתרון DNase לדלל 100 מ"ג של אבקה lyophilized של DNase I (בקבוק אחד) ב 50 מ"ל של H2O. מערבבים היטב ולסנן את תמיסת המלאי. הכן 10 מ"ל מניות aliquots. חלק צינור מניות אחד ל -0.5 מ"ל aliquots חד פעמי. אחסנו את האליציטוטים החד-פעמיים האלה בטמפרטורה של -80°C.
- הכינו ריאגנטים להפרדה מגנטית על ידי הכנת חיץ עמודים מגנטי X: 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ותמיסת חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) 2 mM.
- להכנת מדיה נוירוספרית, יש להשתמש בתווך נוירובזאלי המכיל פניצילין/סטרפטומיצין עם L-גלוטמין ולהשלים עם 2% B27, 20 ng/mL גורם גדילה אפידרמלי רקומביננטי אנושי (EGF), ו-20 ng/mL גורם גדילה פיברובלסט בסיסי רקומביננטי אנושי (bFGF).
- כדי להכין אמצעי התמיינות, השתמש בתווך נוירובזאלי ותוסף עם גורם גדילה נגזר טסיות 10 ng/mL (PDGF-AA) או 10 ng/mL גורם מעכב לוקמיה (LIF) ו -2% B27.
- השתמש בחיבור נמוך במיוחד 12 באר (3.5 ס"מ2) ו 6 באר (9.6 ס"מ2) צלחת תרבית.
2. דיסקציה של המוח הקטן
- מרדימים גורי עכברים (P3-P7) עם איזופלורן ועריפת ראשים באמצעות מספריים כירורגיים.
- רססו את ראשי הגורים המופרדים באתנול 70%.
- מעבירים כל ראש לתבנית תרבית סטרילית ריקה בקוטר 10 ס"מ. להפריד את העור באמצעות מספריים microdissection, ולאחר מכן להסיר את הגולגולת על ידי הפעלת מספריים sagittal לאורך קו האמצע.
- באמצעות #7 מלקחיים, לקלף את עצמות הגולגולת החל caudally מגזע המוח. הרימו בזהירות את המוח באמצעות מרית, תוך שמירה על שלמות המוח הקטן, והעבירו את המוח לצלחת סטרילית טרייה בקוטר 10.0 ס"מ המכילה 15 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן (HBSS) קרה כקרח.
- הניחו את התבשיל המכיל את המוח תחת מיקרוסקופ דיסקציה. באמצעות מלקחיים עדינים #5, להסיר את קרומי המוח וכלי הדם הגדולים מן המוח הקטן ולהפריד את המוח הקטן מגזע המוח באמצעות מרית.
- העבר את המוח הקטן לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 5.0 מ"ל של תמיסת HBSS קרה כקרח. לשטוף את המוח הקטן על ידי שטיפה ו decanting 3x עם 5.0 מ"ל של HBSS.
הערה: כל מוח קטן צריך להיות ממוקם בצינור משלו לעיבוד נוסף.
3. הכנת תרחיף תאים
- הניחו את התבשיל המכיל את המוח תחת מיקרוסקופ דיסקציה. באמצעות מלקחיים עדינים #5, להסיר את קרומי המוח וכלי הדם הגדולים מן המוח הקטן ולהפריד את המוח הקטן מגזע המוח באמצעות מרית.
- העבר את המוח הקטן לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 5.0 מ"ל של תמיסת HBSS קרה כקרח. לשטוף את המוח הקטן על ידי שטיפה ו decanting 3x עם 5.0 מ"ל של HBSS.
הערה: כל מוח קטן צריך להיות ממוקם בצינור משלו לעיבוד נוסף.
- לאחר השטיפה האחרונה, להוסיף 5 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה רקמות מבוססת פפאין כי כבר מחומם מראש ל 37 ° C. לדגור את הרקמה במשך 15 דקות ב 37 ° C באמבט מים. ערבבו באיטיות את התוכן על ידי היפוך הצינור למעלה ולמטה 3x-5x כל 3 דקות באמצעות מיקסר אגוזים או ביד.
- הכינו פיפטת פסטר בקוטר רחב (פיפטת זכוכית רגילה) ופיפטת פסטר בקוטר צר (מלוטשת באש על ידי חימום מעל מבער בונזן) כפי שתואר קודם לכן.
- לשטוף את הרקמה 3x עם 5 מ"ל של פתרון HBSS, למנוע אובדן של הרקמה בעת decanting ביד.
- הסר את שטיפת HBSS האחרונה והוסף 5 מ"ל של תמיסת DPBS המכילה 250 μL של תמיסת DNase לרקמה. נתק את הרקמה על ידי טריטוציה 10x-15x באמצעות פיפטה פסטר בקוטר רחב. בצע שלב זה בעדינות כדי למנוע היווצרות של בועות.
- לאחר מכן לדגור את slurry במשך 10 דקות נוספות ב 37 ° C באמבט המים, ערבוב על ידי היפוך ויישור הצינור.
- השתמש פיפטה פסטר בקוטר מופחת כדי triturate עוד יותר את slurry רקמות 10x. אם נשארות חתיכות גדולות של רקמה, לחץ את חתיכות הרקמה על תחתית הצינור עם קצה הפיפטה בעדינות והמשך בפיפט עד שהתאים מגיעים לתרחיף עדין.
- דוגרים על הרקמה בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות נוספות, תוך חזרה על שלבי הערבוב הקודמים.
4. תיוג חיסוני של תאי גזע
- הניחו את צינורות הצנטריפוגות על קרח והשתמשו בתמיסות קרות כקרח לשלבים הבאים. מסננים את התאים המנותקים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. מעליו את המסנן בתמיסת HBSS בנפח 10.0 מ"ל כדי להבטיח שהתאים יעברו דרך הרשת בתמיסה נוספת זו.
- מעבירים את התאים המסוננים לצינור צנטריפוגה טרי של 15 מ"ל וצנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C. שואפים ומשליכים את הסופרנאטנט לחלוטין על ידי שימוש בזהירות בשואב ואקום.
- השהה מחדש את הגלולה ב 160 μL של מאגר עמוד מגנטי. כדי לקבל את המתלה החד-תאי לפני התיוג המגנטי, העבירו תאים דרך רשת ניילון של 30 מיקרומטר כדי להסיר גושי תאים, שאחרת עלולים לסתום את העמודה.
- הוסיפו 40 מיקרו-כדוריות אנטי-פרומינין-1 לכל צינור של 15 מ"ל, ערבבו ודגרו במקרר למשך 15 דקות על מנת שהנוגדן ייקשר לתאים המבטאים בולטין-1.
- שטפו את התאים על ידי הוספת 1.0-2.0 מ"ל של חיץ עמוד X וצנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנאטנט לחלוטין.
- השהה מחדש את הגלולה ב- 1.0 מ"ל של מאגר עמודות X.
הערה: אם גושים קטנים נראים לאחר השעיית הגלולה עם 1.0 מ"ל של חיץ טור X, יש להסיר אותם בזהירות באמצעות קצה פיפטת פסטר, אחרת גושים אלה יכולים לחסום את העמוד המגנטי במהלך מיון התא.
5. הכנת עמוד מגנטי, מיון תאים וציפוי
הערה: ההפרדה המגנטית מתנאי גנוטיפ שונים (מחלה לעומת בקרה) חייבת להתבצע בו זמנית, שכן כל עיכוב עלול להשפיע על המורפולוגיה של הנוירוספרה.
- הכינו את העמודים המגנטיים על ידי הצבתם על המעמד המגנטי החשוף לשדה המגנטי. שטפו את העמוד פעם אחת עם 500 μL של חיץ X על ידי הפעלת חיץ שמטפטף לתוך צינור צנטריפוגה שיש להשליך.
הערה: הכינו חיץ עמודים מגנטי טרי X לכל ניסוי; אם לא, אז תפוקת תאי הגזע תהיה נמוכה.
- החל את השעיית התא המסומנת על העמודה. אספו את הזרימה שמכילה תאים לא מסומנים שמורכבים בעיקר מתאים מעורבים של תאי עצב במוח הקטן/גליה לתוך צינורות טריים של 15 מ"ל (איור 1A).
- שטפו את העמוד 3x עם 500 μL של חיץ X (כל שטיפה אורכת בערך 2-4 דקות).
הערה: התרבות המעורבת של תאי העצב במוח הקטן / גליה המועשרת בנוירונים גרגיריים צרבלריים יכולה לשמש כתוצר לוואי שימושי של שלב טיהור זה.
- הסר את העמוד מהשדה המגנטי ומקם אותו בצינור של 1.5 מ"ל. הוסף 1.0 מ"ל של מדיום תרבית (מדיום נוירוספירה) לטור ודחוף את הבוכנה לתוך העמוד כדי לשטוף את התאים המתויגים בחרוזי בולנין-1 לתוך צינור בז טרי של 1.5 מ"ל.
- כדי לשפר את הטוהר של תאים המסומנים ב-prominin-1, העבר את התאים המדוללים על עמודה שנייה לאחר שלבים 5.1-5.4.
- לספור את התאים עם hemocytometer. התשואה האופיינית היא 107 תאים לכל המוח הקטן. לוחו את התאים על לוחות חיבור נמוכים במיוחד (6 או 12 בארות, בהתבסס על הצפיפות הנדרשת לניסויים במורד הזרם).
6. העברת נוירוספרות ודיפרנציאציה
- לוחית את תאי הגזע המסומנים ב- prominin-1 על חיבור נמוך במיוחד 12 צלחות באר בתווך נוירוספרי (5,000 תאים / באר).
- לאחר 7-10 ימים, התאים מתחלקים ומניבים נוירוספרות צפות בצורת כדור (נוירוספרות ראשוניות).
הערה: בניסוי זה, נוירוספרות משניות המתרחבות במספרים נוצרות לשימוש נוסף. אוכלוסיות נוירוספריות ראשוניות אינן משמשות לניסויים אלה מכיוון שהן עשויות להכיל תאים מזהמים שאין להם תכונות של תאי גזע ויכולים להתגבש יחד עם נוירוספרות.
- למעבר, העבר את הנוירוספרות הראשוניות יחד עם אמצעי התרבית באמצעות קצות פיפטה 1.0 מ"ל לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל. הפילו את הנוירוספרות על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
- להשעות מחדש את הגלולה ב 5 מ"ל של מדיה דיסוציאציה רקמות המכיל פפאין או 0.05% תמיסת טריפסין. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות.
- צנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 x גרם במשך 5 דקות. להשעות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של תווך נוירוספרה לנתק את התאים מכנית באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק ו pipeting איטי למעלה ולמטה 10x.
- לוחית את התאים (שוב) במדיה נוירוספרית כפי שתואר קודם לכן. לאחר 7-10 ימים בתרבית, הצלחת צריכה להיות מועשרת בנוירוספרות משניות.
הערה: תרבויות אלה יכולות לעבור עד פי 8 ביעילות טובה, ולאחר מכן גודל הנוירופרה נוטה להיות קטן יותר ומרמז על ירידה בהתפשטות.
- ספרו את התאים על ההמוציטומטר וקבעו את המספר האופטימלי לניסויים עתידיים על לוחות מצופים פולי-D-ליזין (6 או 12 בארות).
- כדי להבדיל את תאי הגזע, לאסוף נוירוספרות מן המעבר השני עד השמיני על ידי צנטריפוגה כפי שתואר קודם לכן, למעט הוספת מדיום התמיינות לכדור.
הערה: לאחר 7 ימים במבחנה, תאי הגזע מתמיינים לנוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים, כפי שמודגם על ידי צביעה בסמן העצבי β-III טובולין, סמן אסטרוציטי חלבון חומצי פיברילרי גליאלי (GFAP), וסמן אוליגודנדרוציטים O4.
