כימות decrements קוגניטיבי נגרמת על ידי הקרנות גולגולתי

סיכום

ליקוי קוגניטיבי הנובע מטיפול רדיותרפי בגידולי מוח מהווה מצב קליני שקשה לטיפול, המשפיע לרעה על איכות החיים. היכולת להעריך באופן ביקורתי התערבויות פוטנציאליות לשיפור פגיעות קוגניטיביות הנגרמות מקרינה תלויה בסופו של דבר ביכולת לבצע הערכות כמותיות קפדניות של התפקוד הקוגניטיבי.

תקציר

מלבד שיעורי ההישרדות, ליקוי קוגניטיבי הנובע מהניהול הקליני של סרטן הוא גורם מרכזי הקובע את התוצאה הטיפולית. עבור מטופלים רבים הסובלים מממאירות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) וממאירות שאינה של מערכת העצבים המרכזית, רדיותרפיה וכימותרפיה מציעות את האפשרויות הטובות ביותר לשליטה במחלה. עם זאת, טיפולים אלו כרוכים במחיר, וכמעט כל השורדי הסרטן (~11 מיליון בארה"ב לבדה נכון לשנת 2006) נושאים סיכון מסוים לפיתוח תפקוד קוגניטיבי לקוי, כאשר המקרים החמורים ביותר נמצאים בקרב מטופלים שהוכפפו לרדיותרפיה קראניאלית (~200,000 לשנה) לשליטה בגידולי מוח ראשוניים ומטסטטיים¹. בעייתיים במיוחד הם המקרים הפדיאטריים, שבהם הישרדות לטווח ארוך המלווה בירידה קוגניטיבית ניכרת מובילה לנטל סוציו-אקונומי משמעותי². נכון להיום, עדיין אין פתרונות מספקים לבעיה קלינית משמעותית זו.

טיפלנו בחשש הבריאותי החמור הזה באמצעות שימוש בתאי גזע מושתלים כדי להילחם בירידה קוגניטיבית מושרית קרינה בחולדות אתמיות (athymic) שהוכרחו להקרנה קרניאלית³. פרטים על ההקרנה הסטריאוטקסיס ועל התרבית במעבדה (in vitro) והשתלת תאי גזע עצביים אנושיים (hNSCs) ניתן למצוא במאמר המלווה שלנו (Acharya et al., JoVE reference). בעקבות ההקרנה וניתוח ההשתלה, נבחנות החולדות לשינויים בקוגניציה, הישרדות תאי השתל וביטוי של סממנים ספציפיים של התמיינות חודש אחד וארבעה חודשים לאחר ההקרנה. כדי להעריך באופן ביקורתי את ההצלחה או הכישלון של כל התערבות פוטנציאלית שנועדה להקל על השלכות קוגניטיביות מושרית קרינה, יש לבצע סדרה קפדנית של משימות קוגניטיביות כמותיות. כדי להשיג זאת, אנו מעבירים את בעלי החיים שלנו סדרה של פרדיגמות לבדיקה קוגניטיבית, הכוללות זיהוי מקום חדש, מבוך מים, מבוך פלוס מוגבה והתניית פחד, במטרה לכמת למידה וזיכרון היפוקמפליים ולא-היפוקמפליים. הדגמנו את התועלת של בדיחות אלו לכימות סוגים ספציפיים של ליקויים קוגניטיביים בבעלי חיים שהוקרנו, והשתמשנו בהן כדי להראות שבעלי חיים שהושתלו בהם hNSCs מראים שיפורים משמעותיים בתפקוד הקוגניטיבי³.

היתרונות הקוגניטיביים הנובעים מהשתלת תאי גזע אנושיים מרמזים כי אסטרטגיות דומות עשויות לספק בעתיד מענה קליני נחוץ לשורדי סרטן הסובלים מליקויים קוגניטיביים. בהתאם לכך, סיפקנו תיעוד כתוב וחזותי של השלבים הקריטיים ששימשו בפרדיגמות הבדיקה הקוגניטיבית שלנו, כדי להקל על תרגומם של תוצאותינו המבטיחות ליישום קליני.

פרוטוקול

פרוטוקולי הבדיקות הקוגניטיביות שלנו מוצגים באופן סכמטי באיור 1. הבדיקות הקוגניטיביות מתחילות חודש אחד לאחר ההקרנה וביצוע ההליכים הכירורגיים.

ביצוע משימת זיהוי מקום חדש (NPR)

1. מטלת זיהוי מקום חדש (NPR) מבוססת על פרוטוקולים שתוארו על ידי Mumby ועמיתיו (2002), והיא מהווה מטלה של זיכרון זיהוי מרחבי הנשענת על ההיפוקמפוס⁴.
2. בתחילה, החולדות עוברות היכרות עם סביבת הבדיקה על ידי הצבתן בזירות הבדיקה (קופסאות אקרילי לבנות ללא מכסה, מתוחזקות בהתאמה אישית, בגודל 70cm X 70cm X 40cm גובה) למשך 20 דקות, פעם ביום במשך שלושה ימים. במהלך מפגשי ההרגלה אלו, מוצבים בזירות חפצים שלא ישמשו לבדיקה מאוחרת יותר.
3. בשלב ההרגלה, יש לתעד תצפיות ידניות של התנהגות חקרנית, בעוד שהקלטה ומעקב אחר ההתנהגות אינם נחוצים.
4. בכל שלבי מטלת ה-NPR, יש לנקות את הזירות ביסודיות בין חיה לחיה באמצעות 70% ethanol כדי למזער רמזי ריח מבלבלים. בכל הניסויים, הנסיינים מציבים את החיות במרכז זירות הבדיקה בכיוון עקבי, כדי למזער את הסיכוי שהחיות פשוט יחקרו את הבלוק שקרה להן להיות מוצבות לצידו.
5. שלב ההיכרות ושלב הבדיקה בן 5 הדקות נערכים ביום הרביעי.
6. בשלב ההיכרות, שני בלוקים פלסטיים זהים (8cm X 3cm X 10cm גובה) שנוקו ביסודיות עם 70% ethanol מוצבים במיקומים ספציפיים בתוך זירות הבדיקה. חיה אחת מוצבת בכל זירה למשך 5 דקות ומורשית לחקור בחופשיות.
7. חקר שני המיקומים המרחביים המוכרים במידה שווה נמדד באמצעות מערכת מעקב אוטומטית. בכל השלבים, חקירה מוגדרת כנקודת האף של החיה הנמצאת ברדיוס של 4cm מהבלוקים ומופנית לעברם.
8. בעקבות שלב ההיכרות, החיות מוצבות בכלוב המתנה קטן לפרק זמן של 5 דקות. במהלך זמן זה, זירות הבדיקה מנוקות עם 70% ethanol, ומוספים עותקים זהים של הבלוקים; אחד במיקום מרחבי זהה לזה של שלב ההיכרות, ואחד במיקום מרחבי חדש. אם חולדה זוכרת את הסידור המרחבי של הבלוקים משלב ההיכרות, היא תבלה זמן רב יותר בחקירת הבלוק הממוקם במיקום המרחבי החדש.
9. לאחר פרק ההמתנה בן 5 הדקות, החיות מוחזרות לזירות הבדיקה לשלב הבדיקה בן 5 הדקות. הן חוקרות בחופשיות במשך 3 דקות.
10. 24 שעות לאחר סיום שלב ההיכרות, החיות מוחזרות שוב לזירות הבדיקה לשלב הבדיקה של 24 שעות. בשלב זה, בלוק אחד נשאר באותו מיקום כפי שהיה בשלבי ההיכרות והבדיקה של 5 הדקות, והבלוק השני מוצב במיקום מרחבי חדש. שוב, אם חולדה זוכרת את הסידור המרחבי של הבלוקים משלב ההיכרות מהיום הקודם, היא תבלה זמן רב יותר בחקירת הבלוק הממוקם במיקום המרחבי החדש.
11. כעת, נאסף משך הזמן שהוקדש לחקירת הבלוקים במיקומים המרחביים השונים באמצעות תוכנת המעקב האוטומטית, וניתן לנתח נתונים אלו סטטיסטית כדי לבחון הבדלים בין הקבוצות הניסוייות.
12. עבור שלב ההיכרות, מחושב הזמן הכולל שהוקדש לחקירת שני המיקומים המרחביים לאורך כל הניסוי. לא אמור להיות הבדל בזמן שהוקדש לחקירת שני המיקומים המרחביים במהלך שלב זה, שכן שניהם מוכרים/לא מוכרים במידה שווה לחיות (Fig. 2A). יתרה מכך, הבדלים משמעותיים בחקירה הכוללת בין הקבוצות הניסוייות עשויים להעיד על הבדלים קבוצתיים במוטיבציה לחקור או ברמות חרדה, ויש לקחתם בחשבון בעת פירוש תוצאות זיכרון הזיהוי המרחבי משני שלבי הבדיקה.
13. עבור שני שלבי הבדיקה, של ה-5 דקות ושל ה-24 שעות, מחושב יחס חקירה באופן הבא: זמן חקירת המיקום החדש פחות זמן חקירת המיקום המוכר, חלקי הזמן הכולל שהוקדש לחקירה (Fig. 2B). בדרך זו, נלקחת בחשבון השונות האינדיבידואלית במוטיבציה לחקור את החפצים. חיות נורמליות מבלות זמן רב יותר באופן משמעותי בחקירת המיקום המרחבי החדש מכפי שניתן לצפות במקרה (מסומן בקו המקווקו) לאחר פרקי ההמתנה של 5 דקות ו-24 שעות (Fig. 2B).
14. יחס החקירה מחושב בדרך כלל עבור 60 השניות הראשונות של בדיקות ה-5 דקות וה-24 שעות⁴. זאת משום שככל שניסויי הבדיקה מתקדמים, המיקום המרחבי החדש הופך למוכר יותר עבור החיות. לפיכך, הדקה הראשונה של ניסויי הבדיקה מספקת את ההערכה המדויקת ביותר של זיכרון הזיהוי המרחבי.

2. ביצוע מטלת מבוך הפלוס המוגבה (EPM)

1. משימת מבוך הפלוס המוגבה (EPM) מבוססת על פרוטוקולים של Walf and Frye, 2007⁵.
2. משימת ה-EPM משמשת להערכת חרדה במכרסמים. מכשיר ה-EPM הוא מבוך בעל 4 זרועות (45" X 4") המוגבה 45" מפני הרצפה, כאשר הזרועות מסודרות בצורת פלוס. שתי זרועות הן סגורות ושתיים פתוחות. המכשיר המוצג מיוצר על ידי Med Associates Inc.
3. ההתנהגות במהלך משימה זו משקפת קונפליקט בין המוטיבציה הטבעית של החולדה לחקור סביבות חדשות (זמן השהייה בזרועות הפתוחות) לבין ההעדפה להישאר באזורים מוגנים (זרועות סגורות).
4. חדר הניסוי מואר בבהירות באמצעות זרקורים המופנים אל המבוך כדי להבטיח מוטיבציה מספקת להעדפת הזרועות הסגורות והמעומעמות יותר.
5. המבוך מנוקה ביסודיות לפני בדיקת בעל החיים הראשון, ובין כל ניסוי.
6. בעל החיים מונח במכשיר על ידי החזקתו תחת הגפיים הקדמיות והנחתו בחלק המרכזי של המבוך, כשהוא פונה אל הזרוע הפתוחה הרחוקה מהנסיין. כל ניסוי נמשך 5 דקות.
7. מסלולו של בעל החיים נמעקב באמצעות תוכנת מעקב אוטומטית כך שניתן לחשב את מספר הכניסות ואת משך הזמן שהושה בזרועות הפתוחות והסגורות. ניתן לנטר התנהגויות נוספות כגון התרוממות (rearing), טיפוח (grooming) והטיית ראש מעל דפנות המכשיר. כניסה נספרת כאשר נקודת המרכז של בעל החיים חוצה לתוך זרוע.
8. אם חולדה נופלת מהמבוך, היא מוחזרת במהירות לזרוע הפתוחה ממנה נפלה, והאירוע נרשם במחברת התצפיות. אם חולדה קופאת למשך תקופה ממושכת, ההתנהגות, יחד עם סיבות אפשריות (למשל רעש פתאומי וחזק מחוץ לחדר הבדיקה), נרשמת, והבדיקה נמשכת כדי שלכל בעלי החיים בני הניסוי יהיו זמני חשיפה דומים.
9. הזמן שהושה בזרועות הפתוחות לעומת הסגורות משמש לחישוב היחס: זמן בזרועות פתוחות / זמן כולל בזרועות. באופן דומה, מחושב היחס בין כניסות לזרועות פתוחות לבין סך הכניסות לזרועות. באמצעות תוכנת המעקב האוטומטית, ניתן למדוד גם את סך המרחק שעבר ואת המהירות כדי להעריך הבדלים בתפקוד המוטורי בין קבוצות הניסוי.
10. ירידה בחרדה מקושרת לשיעור גבוה יותר של זמן שהייה בזרועות הפתוחות, בעוד שעלייה בחרדה ובפחד מקושרת לזמן שהייה מרובה יותר בזרועות הסגורות. בעלי חיים נורמליים מבלים זמן פחות משמעותית בזרועות הפתוחות ממה שצפוי במקרה (מסומן על ידי הקו המקווקו, איור 3). בעלי חיים חרדתיים יותר יבלו באופן יחסי פחות זמן בזרועות הפתוחות, בעוד שבעלי חיים פחות חרדתיים יבלו יותר זמן בזרועות הפתוחות (לדוגמה, לאחר חשיפות מרובות למבוך או בעקבות טיפול בתרופות חרדתיות).

3. ביצוע משימת התניית פחד תלוית-הקשר ותלוית-רמז (FC)

1. תיאורי משימות התניית פחד (FC) תלוית-הקשר ותלוית-רמז מבוססים על נהלים של Schafe et al., 1999, Winocur et al., 2006 ו-MacLeod et al., 2007^6-8.
2. משימת התניית פחד (FC) היא פרדיגמה התנהגותית שבה בעלי חיים לומדים לפחד מגירוי שהיה ניטרלי בעבר (הקשר, אור או צליל; הגירוי המותנה) על ידי הצמדתו לגירוי מזיק (בדרך כלל הלם חשמלי קל בכף הרגל; הגירוי הבלתי מותנה). הלמידה היא מהירה, חזקה וארוכת טווח, ולכן משימת ה-FC משמשת לעיתים קרובות לחקר המעגלים הנוירוביולוגיים של למידה וזיכרון במכרסמים.
3. מערך ה-FC הוא תא סגור בגודל 30cm X 30cm וגובה 40cm (Phenotyper, Model 3000, Noldus Information Technology). רצפת התא מורכבת מרשת פלדת אל-חלד המשמשת להעברת גירוי ההלם. ה-Phenotyper מצויד ברמקול המפיק צליל בתדר 2300Hz ובעוצמה של 90dB לפי דרישה, המשמש כגירוי המותנה.
4. ההלם מועבר באמצעות מחולל הלם (Med Associates Inc.). ההלם הוא אי-נוחות רגעית שאינה גורמת לכאב מתמשך או לנזק לרקמות. הן בניסויי האימון והן בניסויי הבדיקה, העיתוי והשליטה בהעברת גירויי ההלם והצליל מבוצעים באופן אוטומטי באמצעות מודול בקרת החומרה והניסוי של התוסף Ethovision XT (גרסה 7.0; Noldus Information Technology).
5. ביום הראשון מבוצע אימון FC. ה-Phenotyper מנוקה ביסודיות עם 70% אתנול, ובעל חיים בודד מוצב בתא. ניסוי האימון מורכב משלושה שלבים; (1) שלב בסיס (baseline), שבו לא ניתן הלם או צליל, (2) שלב אימון, שבו מוצמדים צליל והלם, ו-(3) שלב לאחר אימון, שבו לא ניתן הלם או צליל. כל שלב נמשך כ-5 דקות, לסך זמן ניסוי אימון של 15 דקות לבעל חיים.
6. במהלך שלב האימון, הצליל מושמע למשך 30 שניות ובמקביל לסיום הצליל, מועבר הלם של 1mA לרשת למשך שנייה אחת. הצמדת צליל-הלם זו חוזרת על עצמה סה"כ 5 פעמים, עם מרווחים משתנים של 10 עד 60 שניות בין כל הצמדה.
7. משלב האימון, אחוז הזמן שבו כל בעל חיים נשאר ללא תנועה, או קפוא (freezing), נמדד מ-60 השניות האחרונות של שלב הבסיס הראשוני (כדי לקבוע קפיאה ספונטנית לפני הצמדות הצליל-הלם) ומ-60 השניות האחרונות של השלב שלאחר האימון (כדי לקבוע התנהגות קפיאה בתגובה להצמדות הצליל-הלם). בעלי חיים נורמליים מראים רמות נמוכות מאוד של קפיאה במהלך שלב הבסיס ורמות גבוהות מאוד (~95%) של קפיאה במהלך השלב שלאחר האימון (Fig. 4).
8. לאחר 24 שעות, בעל החיים מוחזר לאותו הקשר בדיוק ונצפה למשך 5 דקות בבדיקת FC תלוית-הקשר. בשלב זה לא ניתן הלם או צליל, ואחוז הזמן שבו בעל החיים נמצא במצב קפיאה מחושב עבור כל הניסוי. שימו לב לחשיבות השמירה על הקשר קבוע מהאימון ועד לבדיקת ההקשר. למעשה, נדרש שאותו נסיין יטפל בבעלי החיים ויבצע את הבדיקה בשני הימים. בעלי חיים נורמליים שוהים בכ-70% מזמן ניסוי ההקשר בהתנהגות קפיאה (Fig. 4).
9. בדיקת FC תלוית-רמז מבוצעת שעה לאחר מכן. הקשר של התא משונה על ידי הסרת רצפת הרשת, הוספת לוחות לצד החיצוני של התא, וניקוי הרצפה בחומר ניקוי ביתי ריחני. התנהגות הקפיאה של בעל החיים נצפית במהלך הדקה הראשונה, ורמות הקפיאה נמוכות מאוד אם ההקשר שונה מספיק (Fig. 4). לאחר מכן מושמע הצליל למשך 3 דקות, ואחריו דקה אחרונה של שקט, ומחושב אחוז הזמן שבו בעל החיים נמצא במצב קפיאה. בעלי חיים נורמליים מראים רמות קפיאה גבוהות בזמן זה (Fig. 4).
10. בסך הכל, נאספות 5 מדידות נפרדות של התנהגות קפיאה; (1) בסיס; (2) לאחר אימון; (3) בדיקת הקשר; (4) בדיקת טרום-רמז; (5) בדיקת רמז ולאחר-רמז.
11. היעדר קפיאה במהלך שלב הבסיס מעיד על רמות חרדה נורמליות, בעוד שקפיאה משמעותית במהלך השלב שלאחר האימון מעידה על יכולת סנסורית-מוטורית תקינה. קפיאה במהלך בדיקת ההקשר מעידה על זיכרון של 24 שעות להקשר האימון, הנשען על תפקוד תקין של ההיפוקמפוס והאמיגדלה⁹. היעדר קפיאה בבדיקת טרום-הרמז מעיד על שינוי מספיק של הקשר האימון הראשוני. קפיאה בזמן הרמז ולאחריו מעידה על זיכרון של 24 שעות לגירוי הצליל, הנשען על תפקוד תקין של האמיגדלה⁹.

4. ביצוע מטלת מבוך המים של מוריס (MWM)

1. נהלי משימת מבוך המים של מוריס (Morris Water Maze) מבוססים על תיאורים קודמים^10,11.
2. משימת מבוך המים של מוריס (MWM) היא מבחן ללמידה מרחבית עבור מכרסמים, הדורש שימוש ברמזים מרוחקים (distal cues) כדי לאתר פלטפורמת מילוט שקועה בבריכה גדולה של מים אטומים. רמזים ויזואליים גדולים ומובחנים ממוקמים מסביב לבריכה במיקומים קבועים וספציפיים. בעלי החיים לומדים להשתמש ברמזים אלו כדי לנווט אל הפלטפורמה השקועה. בעלי החיים נמצאים תחת ניטור ומוצאים מהמים אם אינם מסוגלים לשחות.
3. למידה מרחבית מוערכת לאורך ניסיונות חוזרים, וזיכרון ייחוס (reference memory) נקבע על ידי הערכת ההעדפה לאזור הפלטפורמה כאשר הפלטפורמה אינה קיימת. ניסיונות היפוך (reversal trials) משפרים את הגילוי של ליקויים מרחביים, ועשויים להפעיל אזורי מוח נוספים כגון קליפת המוח הפרונטלית¹⁰.
4. משימת ה-MWM מבוצעת לאורך 8 ימים ומורכבת מ-4 שלבים: מבחן רמז (cued test), שלב רכישה (acquisition phase), מבחן בדיקה (probe test) לאחר 24 שעות ומבחן למידת היפוך.
5. הבריכה היא מיכל פוליאתילן לבן בהזמנה מיוחדת, בקוטר 200cm ובגובה 60cm. היא ממולאת במים לעומק של כ-30cm ונעשית אטומה באמצעות צבע לבן לא רעיל. טמפרטורת המים נשמרת בין 20 ל-22°C (68 ו-72°F). פלטפורמת המילוט היא מעמד פלסטיק שקוף בהזמנה מיוחדת עם ראש מעגלי בקוטר 10cm. היא ממוקמת כ-1.5cm מתחת לפני המים.
6. מבחן הרמז מורכב מ-4 ניסיונות המבוצעים ביום 1. בניסיונות אלו, דגל שחור-לבן מובחן ממוקם במרכז הפלטפורמה כך שמיקום המילוט ברור לבעלי החיים. כדי לצמצם את השימוש במידע מרחבי במהלך שלב זה, רמזי הקיר מוסרים ומיקומי הפלטפורמה וההתחלה משתנים מניסוי לניסוי. שלב זה מסייע לשלול הבדלים הקשורים לתפקוד סנסורי-מוטורי בין הקבוצות הניסוייות לפני תחילת שלב הרכישה.
7. בכל השלבים של משימת ה-MWM, בעלי החיים מוחזקים תחת הגפיים הקדמיות ומונחים בעדינות במים בנקודת ההתחלה המיועדת, כאשר פניהם לקיר הבריכה. בעלי החיים נבדקים בקבוצות (cohorts) של 8, כך שישנו מרווח של 8 עד 10 דקות בין כל אחד מ-4 הניסיונות היומיים. במהלך המרווחים שבין הניסיונות, בעלי החיים נשמרים בכלובי חימום כדי למנוע היפותרמיה.
8. במבחן הרמז, מותר זמן שחייה מקסימלי של 30 שניות עבור בעל החיים כדי לטפס על הפלטפורמה. אם זמן המקסימום הגיע לפני שבעל החיים נמלט, הנסיין מנחה אותו לפלטפורמה ביד ומניח אותו עליה. בעל החיים נשאר על הפלטפורמה לתקופת מנוחה של 20 שניות לפני שמוחזר לכלוב החימום.
9. עבור כל ניסוי במבחן הרמז, בעל החיים מתחיל ממיקום התחלה שונה וקבוע מראש היקף הבריכה, והפלטפורמה מועברת גם היא לכל אחד מ-4 מיקומי הרביעים השונים.
10. שלב הרכישה מתחיל ביום למחרת ומורכב מ-4 ניסיונות ליום במשך 5 ימים רצופים. במהלך שלב זה, הפלטפורמה החבויה נשארת באותו מיקום ובעלי החיים לומדים לנווט אליה באמצעות רמזי החדר המרוחקים.
11. שוב, עבור כל אחד מ-4 הניסיונות, בעל החיים מונח בבריכה בנקודת התחלה שונה וקבועה מראש. מדי יום, שתי נקודות התחלה נמצאות משמאל ושתי נקודות התחלה נמצאות מימין לפלטפורמה, בסדר אקראי, כדי למנוע פיתוח של אסטרטגיות מרחביות אגוצנטריות לפתרון המשימה.
12. זמן השחייה המקסימלי לכל ניסוי רכישה הוא 60 שניות, שלאחריו הנסיין מנחה את בעל החיים ומניח אותו על הפלטפורמה. בעל החיים נשאר על הפלטפורמה למשך 20 שניות לאחר המילוט.
13. ביום 7, 24 שעות לאחר ניסוי האימון האחרון, מבוצע ניסוי בדיקה של 60 שניות שבו הפלטפורמה מוסרת. שלב זה קובע את העדפת בעל החיים לרביע שבו הייתה נמצאת הפלטפורמה ומשמש כמדד לזיכרון ייחוס מרחבי¹⁰. לאחר ניסוי הבדיקה, הפלטפורמה מוחזרת לאותו רביע ומבוצעים 3 ניסיוני רכישה רגילים.
14. עבור מבחן למידת ההיפוך ביום 8, הפלטפורמה מועברת למיקום חדש כדי להעריך את יכולת למידת ההיפוך. מדידת כמות הזמן שבעלי החיים מבלים בחיפוש אחר הפלטפורמה במיקומה הקודם לעומת מיקומה החדש מספקת הערכה של פרסברציה (perseveration), או חוסר יכולת לדכא תגובה למיקום הקודם לאחר שהפלטפורמה הועברה¹⁰. בדומה לשלבי הרכישה והבדיקה, מבוצעים 4 ניסיונות של 60 שניות.
15. במבחן הרמז, זמן ההגעה (latency) למציאת הפלטפורמה והמהירות משמשים כמדדים לתפקוד ויזואלי ומוטורי, בהתאמה. יש להתחשב בהבדלים בין הקבוצות הניסוייות במהלך שלב זה בפרשנות של תוצאות הרכישה והזיכרון, שכן ייתכנו הבדלים בתפקוד הסנסורי-מוטורי בין הקבוצות.
16. בשלב הרכישה, זמן ההגעה הממוצע למציאת הפלטפורמה ו/או אורך המסלול משמשים כמדדים ללמידה מרחבית. בבעלי חיים נורמליים, זמן ההגעה למילוט פוחת בהדרגה לאורך חמשת ימי הרכישה, כך שזמן המילוט הממוצע הוא כ-15 עד 20 שניות ביום 5 (איור 5A).
17. בשלב הבדיקה, המרחק הממוצע לפלטפורמה (איור 5B) ו/או זמן ההגעה הראשוני למיקומה הקודם של הפלטפורמה (איור 5C) משמשים כמדדים לזיכרון ייחוס מרחבי.
18. בשלב ההיפוך, אחוז הזמן שהוקדש לרביע הישן לעומת הרביע החדש המכיל את הפלטפורמה משמש כמדד לפרסברציה. לאורך ארבעת הניסיונות, ההעדפה למיקום הפלטפורמה הישן אמורה לרדת ככל שהעדפה למיקום הפלטפורמה החדש מתבססת (איור 5D).

5. תוצאות מייצגות:

איור 1. ייצוג סכמטי של פרדיגמות הבדיקה הקוגניטיבית שלנו.

איור 2. תוצאות מייצגות מבעלי חיים מקבוצת הביקורת במטלת זיהוי מקום חדש. A) הזמן הכולל שהוקדש לחקירת שני המיקומים המרחביים צריך להיות שווה בקירוב במהלך שלב ההכרות. B) יחס החקירה (הזמן שהוקדש לחקירת המיקום החדש / הזמן שהוקדש לחקירת שני המיקומים) מראה העדפה ברורה למיקום המרחבי החדש לאחר מרווחי השהיה של 5-minute ו-24-hour. הקו המקווקו מציין ביצועי מקרה.

איור 3. תוצאות מייצגות של חיות ביקורת במבוך פלוס מוגבה. חיות נורמליות מבלות זמן קצר מהצפוי במקרה בזרועות הפתוחות (מסומן בקו המקווקו). חיות חרדתיות יבלו זמן קטן באופן יחסי בזרועות הפתוחות בהשוואה לביקורות, בעוד שחשיפות מרובות למבוך או טיפול בחומרים אנקסיוליטיים יעלו את הזמן המובלה בזרועות הפתוחות.

איור 4. תוצאות מייצגות מבעלי חיים מקבוצת הביקורת במטלת התניית פחד. רמות נמוכות של קיפאון נצפות במהלך החשיפה הראשונית לתא (baseline), וכאשר ההקשר משתנה לפני בדיקת הרמז (pre-cue test). לעומת זאת, בעלי חיים תקינים מבליים את רוב התקופה שלאחר האימון בהתנהגות קיפאון. אם בעלי החיים זוכרים את ההקשר שבו התרחש האימון לאחר השהיה של 24hr, הם יפגינו התנהגות קיפאון במשך כ-70% מניסוי ההקשר שנמשך 5 דקות. באופן דומה, אם בעלי החיים זוכרים את הצליל, הם יראו רמות גבוהות של קיפאון במהלך בדיקת הרמז ובבדיקה שלאחר הרמז (post-cue test).

איור 5. תוצאות מייצגות מבעלי חיים מקבוצת הביקורת במטלת מבוך המים של מוריס. A) השהיית המילוט פוחתת עם אימון הדרגתי במהלך שלב הרכישה. B) ו-C) המרחק הממוצע וההשהיה עד לחצייה הראשונה במיקום הפלטפורמה הקודם במהלך מבחן הגשוש של 24 שעות משמשים כמדדים לזיכרון ייחוס מרחבי. D) למידת היפוך מוערכת על ידי שינוי מיקום הפלטפורמה ביום האחרון של הבדיקה. לאורך 4 הניסיונות, בעלי חיים רגילים מפסיקים בהדרגה לחפש ברביע הישן ולומדים שהפלטפורמה נמצאת במיקום חדש.

דיון

קיים צורך דחוף באסטרטגיות ארוכות טווח שנועדו למנוע את התפתחותה של ליקוי קוגניטיבי ההופך לנפוץ יותר ויותר בקרב שורדי סרטן^12,13. טיפולים בתאי גזע עשויים לספק את האמצעים לשיפור מגוון של השלכות על רקמות נורמליות במערכת העצבים המרכזית (CNS), שכן הם מאפשרים החלפה של תאים שאבדו או ניזוקו כתוצאה מטיפולי סרטן ציטוטוקסיים¹⁴. כדי להאיץ את מימוש מאמצים אלה, ביצענו סדרה של ניסויי הוכחת עיקרון אשר אישרו את היכולת של hNSCs שהושתלו גולגולתית לשקם תפקודית את הקוגניציה בתוך מצע הרקמה שהוקרנה של ה-CNS³. מרכיב קריטי במאמץ זה היה היכולת לבצע באופן מהימן סדרה של מבחנים קוגניטיביים מבוקרים בקפידה ובאופן הדיר. פירטנו את הפרוצדורות קריטיים אלה במטרה להאיץ את הפוטנציאל התרגומי של טיפולים בתאי גזע בקליניקה. שיקולים נוספים שסביר להניח שתהיה להם השפעה משמעותית על איכות הנתונים מודגשים להלן.

בדיקות קוגניטיביות דורשות תשומת לב קפדנית לפרטים, והיצמדות לפרקטיקות סטנדרטיות מסוימות יכולה לסייע במיזעור ארטיפקטים המסבכים את פרשנות התוצאות. עדיף להשתמש בחדרי בדיקות התנהגותיות ייעודיים הנפרדים מחדרי החייתים ומהנסיינים. כמו כן, מומלץ להשתמש ב"רעש לבן" החוסם רעשים חיצוניים במכון למחקר חיות שעלולים להסיח את דעתם של בעלי החיים מהמשימה. כדי למזער את הלחץ המוטל על בעלי החיים המיועדים לבדיקות קוגניטיביות, חשוב שהם יכירו את הנסיינים שיבצעו את הבדיקות ההתנהגותיות לפני ביצוע המשימה. באופן כללי, כאשר בודקים נקבות וזכרים, מומלץ לבדוק תחילה את הנקבות, שכן הן נוטות להיות חרדתיות יותר במהלך הבדיקה אם נותרים רמזי ריח של זכרים בזירות הבדיקה. בעת ביצוע סדרה של משימות, חשוב לחשוף את בעלי החיים תחילה למשימות הפחות מלחיצות (כגון EPM, NPR) ולסיום למשימות המלחיצות ביותר (כגון FC, MWM).