טיפוח של נוירוני גנגליון ברשתית עם גליית מעטפת חוש הריח

תקציר

מקור: Portela-Lomba, M., et al. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, כמודל In Vitro של התחדשות אקסונלית בוגרת. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון וידאו זה מדגים את ההליך לבודד נוירונים של גנגליון רשתית (RGNs) מהרשתית של חולדה ולעבד אותם יחד עם תאי גליה (OEG). שיטה זו מאפשרת לחקור את הפוטנציאל הנוירו-רגנרטיבי של OEGs לאחר פגיעה עצבית.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת ihOEG (Ts12 ו-Ts14) לבדיקה

הערה: שלב זה חייב להיעשות 24 שעות לפני נתיחת RGN והתרבות המשותפת.

1. יש לטפל בכיסויי Ø בקוטר 12 מ"מ עם פולי-ל-ליזין (PLL) בגודל 10 מיקרוגרם/מ"ל למשך שעה < ל-> הערה: את הכיסויים ניתן להשאיר למשך הלילה בתמיסת PLL.
2. שטפו את הכיסויים במי מלח חיץ פוספט (PBS) שלוש פעמים.
3. נתקו תאי ihOEG Ts12 ו-Ts14 מצלחת תרבית התאים p60.
   1. הוסף 4 מ"ל של DMEM/F12 (בינוני בסיסי)-FBS (נסיוב בקר עוברי) מדיום לצינור חרוטי 15 מ"ל. חם ב 37 °C (77 °F) באמבט מים נקיים.
   2. הסר את המדיום מן הצלחות ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של 1x PBS (פוספט-buffered מלוחים)-EDTA (אתילן diamine tetraacetic חומצה) פעם אחת.
   3. הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לתאי OEG ודגור במשך 3-5 דקות ב 37 ° C, 5% CO₂.
   4. לאסוף תאים עם פיפטה p1000 ולהעביר אותם למדיום מוכן בשלב 2.1.
   5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 200 x גרם.
   6. לשאוף את supernatant.
   7. הוסף 1 מ"ל של מדיום ME10 והשהה מחדש את הכדור.
   8. ספור את מספר התא בהמוציטומטר.
4. זרעו 80,000 תאי Ts14 או 100,000 תאי Ts12 / היטב על הכיסויים בצלחות 24 בארות ב 500 מיקרוליטר של מדיום ME10.
5. תאי תרבית ב 37 ° C ב 5% CO₂ במשך 24 שעות.

2. דיסקציה של רקמת הרשתית

הערה: חולדות Wistar זכרים בני חודשיים משמשים כמקור RGN. שתי רשתיות (חולדה אחת) ל-20 בארות של צלחת של 24 בארות. חומר כירורגי אוטוקלאבי לפני השימוש. ערכת דיסוציאציה Papain נרכשת באופן מסחרי (Table of Materials). בצע את הוראות הספק להגדרה מחדש. לבנות מחדש D, L-2-amino-5-phosphonovaleric חומצה (APV) במלאי 5 mM ולהכין את aliquots.

1. ביום הבדיקה, הכינו את המדיה הבאה.
   1. הכינו צלחת תרבית תאים p60 עם 5 מ"ל EBSS קר (תמיסת מלח מאוזנת של ארל) (בקבוקון 1 של ערכת דיסוציאציה פפאין).
   2. הכינו צלחת תרבית תאים p60 עם בקבוקון 2 (פפאין) משוחזר של ערכת דיסוציאציה פפאין בתוספת 50 μL של APV. לאחר מכן, הוסף 250 μL של בקבוקון משוחזר 3 (DNase בתוספת 5 μL של APV).
   3. בצינור סטרילי, מערבבים 2.7 מ"ל של בקבוקון 1 עם 300 μL של בקבוקון 4 (מעכב פרוטאז אלבומין-ovomucoid). הוסף 150 μL של בקבוקון 3 (DNase) ועוד 30 μL של APV.
   4. הכן 20 מ"ל של Neurobasal-B27 בינוני (NB-B27).
2. להקריב חולדה על ידי חנק עם CO₂.
3. הסר את הראש על ידי עריפת ראש עם גיליוטינה; מניחים אותו בצלחת פטרי 100 מ"מ ורסס את הראש עם אתנול 70% לפני הנחתו על מכסה מנוע זרימה למינרית.
4. חותכים את השפם של החולדה עם מספריים כדי שלא יפריעו למניפולציה של העין.
5. אחוז את עצב הראייה עם מלקחיים כדי למשוך את גלגל העין מספיק כדי להיות מסוגל לעשות חתך על פני העין עם אזמל.
6. הסירו את העדשה ואת הזגוגית והוציאו את הרשתית (רקמה כתומה) בעוד שכבות העין הנותרות (כולל שכבת אפיתל הפיגמנט) נשארות בפנים.
7. הניחו את הרשתית בצלחת תרבית תאים p60 שהוכנה בשלב 2.1.1.
8. מעבירים את הרשתית לצלחת תרבית התאים p60 שהוכנה בשלב 2.1.2 וחותכים אותה עם האזמל לחתיכות קטנות בגודל משוער < 1 מ"מ.
9. מעבירים לצינור פלסטיק 15 מ"ל.
10. לדגור על הרקמה במשך 30 דקות, באינקובטור לח ב 37 ° C תחת 5% CO₂, עם תסיסה כל 10 דקות.
11. נתק גושי תאים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם פיפטה פסטר זכוכית.
12. צנטריפוגה את מתלה התא ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
13. השליכו את הסופרנטנט. כדי להשבית פפאין, להשעות מחדש את גלולת התא בתמיסה שהוכנה בשלב 2.1.3 (1.5 מ"ל עבור 2 עיניים).
14. בזהירות צינור זה תא השעיה לתוך 5 מ"ל של בקבוקון reconstituted 4.
15. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
16. תוך כדי צנטריפוגה, הסר לחלוטין את מדיום ME-10 מלוח תא הבאר OEG 24 (שהוכן קודם לכן בשלב 1) והחלף אותו ב- 500 μL של מדיום NB-B27 לכל באר.
17. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-2 מ"ל של תווך NB-B27.
18. צלחת 100 μL של תרחיף תאי רשתית, לכל באר של צלחת m24, על PLL מטופל או OEG monolayers-coverslips.
19. שמור על תרביות בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ למשך 96 שעות ב-NB-B27 בינוני.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוספת B-27	גיבקו	17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric חומצה	סיגמא	283967	מעכב קולטן NMDA
DMEM-F12	גיבקו	11320033	מדיום תרבית תאים
פ.ב.ס.	גיבקו	11573397	סרום בקר עוברי
FBS-Hyclone	פישר סיינטיפיק	16291082	סרום בקר עוברי
ל-גלוטמין	לונזה	BE17-605F
מדיום נוירובזלי	גיבקו	21103049	מדיום תרבית תאי עצב
מערכת דיסוציאציה פפאין	תאגיד הביוכימיה וורת'ינגטון	LK003150	לשימוש בבידוד תאים עצביים
PBS	תוצרת בית
PBS-EDTA	לונזה	H3BE02-017F
פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוטריצין B	לונזה	17-745E	בקטריוסטטיקה וקוטל חיידקים
תמצית יותרת המוח	גיבקו	13028014	תמצית יותרת המוח של בקר
פולי-L- ליזין (PLL)	סיגמא	A-003-M