טכניקה לבידוד תאי לוויין מרקמת שריר ראש חולדה

תקציר

מקור: Carvajal Monroy, P. L., et al. בידוד ואפיון תאי לוויין משרירים מסועפים של ראש חולדה. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים את הבידוד של תאי לוויין מרקמות שריר מסועפות של ראש חולדה באמצעות דיסקציה של רקמות, עיכול אנזימטי וטיהור מכני וצנטריפוגלי לאחר מכן. לאחר מכן זורעים את התאים על בארות מצופות מטריצה חוץ-תאיות לצורך התמיינות למיובלסטים, ובסופו של דבר לצינורות מיו-צינור וסיבי שריר בוגרים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. כתמי ג'ל מטריצה חוץ-תאיים

1. יש לבצע את השלבים הבאים יום לפני הבידוד:
   1. הפשיר אליקוט של ג'ל מטריצה חוץ-תאי (100 μl) ב-4°C למשך שעה וחצי לפחות. יש לדלל ביחס 1:10 בתווך הנשר המעובד של Dulbecco; עם 4,500 מ"ג/ליטר גלוקוז, 4 מ"מ L-גלוטמין ו-110 מ"ג/מ"ל נתרן פירובט (DMEM). שמור את ג'ל המטריקס החוץ תאי על 4 ° C בכל עת.
      הערה: שינויי טמפרטורה פתאומיים יגרמו לציפוי לא אחיד ולהיווצרות גביש.
   2. שמרו את תמיסת ג'ל המטריקס החוץ תאי המדוללת על קרח למשך 15 דקות.
   3. מצננים מראש מיקרופיפטה של 20 μl למשך 10 דקות.
   4. הכניסו את המגלשות בעלות 8 בארות לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ והעבירו את התבשיל למשטח קר (למשל חבילת הקפאה) למשך 10 דקות.
   5. השתמש micropipette מראש מצונן לשים טיפה של 10 μl ג'ל מטריצה תאית בכל באר. שמרו את צלחת הפטרי על המשטח הקר לפחות עוד 7 דקות (איור 1A).
   6. הסירו לחלוטין את ג'ל המטריצה החוץ-תאי שנותר (איור 1B) וייבשו את הבארות בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.

2. דיסקציה של שרירי הראש (Masseter, Digastric, and Levator Veli Palatini)

1. לפני הנתיחה, להכין 50 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS) בתוספת 2% פניצילין-סטרפטומיצין (P / S). שמור על קרח.
2. לאחר המתת חסד של חולדה בוגרת צעירה אחת (9 שבועות) עם CO₂/O₂, ערפו את ראשו והסירו את העור מהראש. העבירו את הראש ל-PBS קר כקרח בתוספת P/S של 2% בצינור של 50 מ"ל.
3. שריר המסה (נגזר מהקשת המסועפת הראשונה)
   1. הניחו את הראש עם צד אחד למעלה על כרית סיליקון וקיבעו אותו באמצעות מחטים היפודרמיות (איור 2A).
   2. זהו את בלוטת הפרוטיד ואת עצב הפנים (איור 2A). יש לחשוף את הפאשיה העמוקה המכסה את הבלוטה. חותכים את הפאשיה ומסירים את הבלוטה בעזרת מספריים לדיסקציה. זהה את תעלת השמע החיצונית. עקוב אחר עצב הפנים מהפתח הסטילומסטואיד והסר בזהירות את הענפים הרקתיים, הזיגומטיים והבוקליים בעזרת להב אזמל מס '15.
   3. שחררו את הראש השטחי של שריר המסה על ידי הסרת הפאשיה. זהה ראשים שטחיים ועמוקים של שריר המסה. עקוב אחר הראש השטחי עד שהאפונוירוזה המגמתית העבה שלו מוחדרת לתהליך הזיגומטי של המקסילה.
   4. מפרידים את הגיד ממקורו בתהליך זיגומטי בעזרת מלקחיים ישרים. גזרו אותו בעזרת להב אזמל מס' 15 או מספריים לדיסקציה והרימו אותו בזהירות (איור 2B).
   5. נתחו את ראשו השטחי של המעסה עד להכנסתו בזווית ובחצי התחתון של פני השטח הרוחביים של הרמוס של הלסת התחתונה בעזרת להב אזמל מס' 15 (איור 2C). עכשיו, להסיר לחלוטין את השריר.
4. הבטן האחורית של שריר הקיבה (נגזר מהקשת המסועפת השנייה)
   1. הניחו את הראש במצב שכיבה על כרית הסיליקון וקיבעו אותו באמצעות מחטים היפודרמיות (איור 3A).
   2. הסר את השומן התת עורי מעל בלוטות תת לשוניות ותת לסתיות. לאחר מכן, הסירו את הפאשיה השטחית ואת הבלוטות באמצעות מספריים לנתיחה. לחשוף את שריר digastric (הבטן הקדמית והאחורית).
   3. החזיקו את הגיד הקדמי של הבטן האחורית בעזרת מלקחיים ישרים, חתכו אותו ונתחו אותו בזהירות עד שמקורו בבולה הטימפנית (איור 3B). עשו את אותו הדבר בצד הנגדי.
5. שריר הלבטור (Levator veli palatini) (נגזר מהקשת המסועפת ה-4)
   1. לאחר כריתה של הבטן האחורית של שריר הקיבה, מקמו את שריר הסטילוהיואיד, משכו אותו לרוחב והוציאו אותו בזהירות (איור 4A).
   2. מקמו את הגיד של ה-levator veli palatini שנכנס לבולה הטימפנית (איור 4A). נתחו אותו בזהירות וחתכו אותו משני הצדדים.
   3. חפשו את קנה הנשימה ואת הוושט שעובר מאחוריו. להרים את הוושט ולחשוף את הלוע ואת הגרון.
   4. למקם ולנתח את האזור של שריר מכווץ הלוע העליון. זהו את ה-levator veli palatini וחתכו אותו משני צדדיו (איור 4B).
      הערה: מיד לאחר הדיסקציה, יש להסיר בזהירות את הגיד ורקמת החיבור מכל שריר מתחת למיקרוסקופ הסטריאו. טבלו את כל הדגימות במהירות באתנול 70% והעבירו אותן ל-PBS קר כקרח בתוספת 2% P/S בצינור של 15 מ"ל.

3. בידוד תאי לוויין (SCs)

1. בצע את שלבי ההכנה הבאים לבידוד SC משלוש קבוצות השרירים:
   1. להכין 7.5 מ"ל של 0.1% pronase ב DMEM. סנן את התמיסה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. חממו מראש את התמיסה ב-37°C באמבט מים למשך 10 דקות לפני הבידוד.
   2. הכינו 35 מ"ל של DMEM בתוספת 10% סרום סוסים (HS) ו-1% P/S. כמו כן, מראש חם ב 37 °C (77 °F) באמבט מים.
   3. הכינו מדיום תרבית של 15 מ"ל המורכב מ-DMEM בתוספת 20% נסיוב בקר עוברי (FBS), 10% HS, 1% P/S ו-1% תמצית עוברי עוף (CEE). חם מראש ב 37 °C (77 °F) באמבט מים.
   4. מצפים מראש שש פיפטות פלסטיק (10 מ"ל) ב-HS ומייבשים לפחות 10 דקות לפני השימוש.
2. במכסה המנוע של התרבית, מעבירים כל שריר לבאר של צלחת 6 בארות. בעזרת מספריים דיסקציה, לחתוך את השריר לחתיכות קטנות של כ 2 מ"מ. היזהר לא לטחון את הרקמה יותר מדי.
3. יש להוסיף בזהירות 2.5 מ"ל של תמיסת פרונאז 0.1% לכל באר ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 60 דקות. נערו בעדינות את הצלחת לאחר 20, 40 ו-60 דקות.
   הערה: משך הדגירה המדויק תלוי בגורמים כמו גיל וזן בעלי החיים.
4. לפקח מתחת למיקרוסקופ. בדקו את חלקי השריר ועצרו את העיכול האנזימטי כאשר צרורות הסיבים נראים משוחררים (איור 5).
5. הוסף 2.5 מ"ל של DMEM בתוספת 10% HS ו 1% P / S. להעביר לצינור 15 מ"ל ולצנטריפוגה את הצינורות ב 400 x גרם במשך 5 דקות. להשליך את supernatant על ידי decantation.
6. הוסף 5 מ"ל DMEM בתוספת 10% HS ו 1% P / S. פיפטה את התמיסה למעלה ולמטה עם פיפטה פלסטיק 10 מ"ל (טריטורציה) לפחות 20 פעמים כדי הומוגניזציה של הרקמה.
7. צנטריפוגה את הצינורות ב 200 x גרם במשך 4 דקות. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו לתוך צינור 15 מ"ל.
8. הוסף 5 מ"ל DMEM בתוספת 10% HS ו 1% P / S. פיפטה שוב עם פיפטה פלסטיק 10 מ"ל עד שברי הרקמה לעבור בקלות.
9. צנטריפוגות את הצינורות ב 200 x גרם במשך 4 דקות ולאסוף את supernatant בצינור 15 מ"ל.
10. שים מסננת תאים (40 מיקרומטר) על צינור 50 מ"ל ולהעביר את supernatant המכיל את התאים מנותקים על המסנן. יש לשטוף עם 1 מ"ל DMEM להתאוששות תאים מרבית.
11. צנטריפוגו את הצינורות במהירות של 1,000 x גרם למשך 10 דקות והשליכו את הסופרנאטנט עם פיפט.
12. להשעות את הגלולה בתווך תרבית 300 μl ולספור את התאים בהמוציטומטר.

4. התמיינות תאי לוויין על כתמי ג'ל מטריצה חוץ-תאיים

1. לדלל את תרחיף התא כדי לקבל 1.5 x 10³ תאים ב 10 μl של מדיום תרבית.
2. אבטחו את הכיסויים של שקופיות התא בסרט הדבקה וסמנו את הכתמים בטוש שחור בצד התחתון של זכוכית האובייקט.
3. באמצעות מיקרופיפטה, הניחו טיפה של תרחיף תאים של 10 μl על נקודת הג'ל של המטריקס החוץ תאי. בדוק תחת המיקרוסקופ אם טיפת תרחיף התא הונחה כראוי במקום. לדגור במשך שש שעות ב 37 ° C.
4. בזהירות להוסיף 400 μl של מדיום תרבית (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, ו 1% CEE) ולדגור במשך שלושה ימים ב 37 ° C.
   הערה: בשלב זה, SC מבודדים טריים נתונים לטראומה מסיבית (עיכול אנזימטי וטריטורציה קשה) והם צריכים להתאושש. אין להפריע לתאים במהלך שלושת הימים הראשונים. לאחר מכן, ניתן לשנות את מדיום התרבית בהתאם לסוג הניסוי.
   כתמי ג'ל מטריצה חוץ-תאיים ניתן לזרוע עם צפיפות תאים גבוהה (1.5-2.5 x 10³/20 μl) עבור בדיקת התמיינות. תרבית בינונית (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / S, ו 1% תמצית עובר תרנגולת) ניתן להחליף כל שלושה ימים.

תוצאות

איור 1: כתמי ג'ל מטריצה חוץ-תאיים בשקופית קאמרית. (A) למניפולציה קלה, הניחו את המגלשה בעלת 8 הבארות לתוך צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ. Pipet 10 μl ג'ל מטריצה תאית בכל תא ולשים אותו על משטח קר (7 דקות). (B) שקופית התא לאחר הסרת עודפי ג'ל המטריקס החוץ-תאי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחט היפודרמית 25 G 0.5 x 25 מטר	מיקרולנס BD	300400
ניתוח מספריים	בראון	BC154R
מיקרו מלקחיים ישר	בראון	BD330R
להב אזמל כירורגי מס' 15	סוואן-מורטון	0205
אלכוהול 70%	דנטק	2,010,005
מגלשת פרמנוקס, 8 תאים	תרמו סיינטיפיק	177445
צלחת תרבית תאים 6 באר	גריינר ביו-וואן	657160
כלי תרבית תאים (100 x 20 מ"מ)	גריינר ביו-וואן	664160
15 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי	BD Biosciences	352097
50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי	BD Biosciences	352098
מסננת תאים (40 מיקרומטר)	גיבקו	431750
10 מ"ל פיפטה סרולוגית	גריינר ביו-וואן	607180
20 μl FT20	גריינר ביו-וואן	774288
מטריג'ל, ללא פנול-אדום	BD Biosciences	356237	10 מ"ל
פרונאז	קלביוכם	53702	10 ק"מ
פוספט חוצץ מלוחים	גיבקו	14190-144	500 מ"ל
Dulbecco's Modified Eagle Medium, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובט	גיבקו	10569-010	500 מ"ל
סרום בקר עוברי	פישר סיינטיפיק	3600511	500 מ"ל
סרום סוסים	גיבקו	26050088	500 מ"ל
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/ml)	גיבקו	15140-122	100 מ"ל
תמצית עוברי עוף	MP Biomedicals	2850145	20 מ"ל