נוירוגנזה הנגרמת על ידי חומצה רטינואית באמצעות תאי קרצינומה עוברית של עכבר

תקציר

מקור: Leszczyński, P., et al., Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים טכניקה פשוטה לנוירוגנזה הנגרמת על ידי חומצה רטינואית בתאי קרצינומה עוברית של עכבר P19. חומצה רטינואית מפעילה גורמי שעתוק ומפעילה ביטוי גנים להתמיינות עצבית.

פרוטוקול

1. יצירת צבירה

1. הוסף 5 μL של RA (חומצה רטינואית) (1 mM מלאי מומס 99.8% אתנול, מאוחסן ב -20 ° C) ל 10 מ"ל של Differentiation Medium ומערבבים היטב (ריכוז סופי של 0.5 μM RA).
   הערה: RA רגיש לאור. ריכוז נמוך של אתנול אינו משפיע על התמיינות תאים.
2. הוסף 10 מ"ל של Differentiation Medium (עם RA) לצלחת התרבית הלא מטופלת בקוטר 100 מ"מ (המוקדשת לתרבית תרחיף).
3. זרעו את 1 x 10⁶ תאים בצלחת 100 מ"מ (שטח פנים צלחת 56.5 סמ"ר).
4. שים את הבקבוק עם תאים לתוך האינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 2 ימים כדי לקדם היווצרות מצטבר.
5. לאחר יומיים, החלף את אמצעי הבידול. לשאוף תווך המכיל אגרגטים באמצעות פיפטה 10 מ"ל ולהעביר לצינור 15 מ"ל ב RT.
6. אפשרו לצברים לשקוע על ידי כוח הכבידה למשך 1.5 דקות ב-RT.
7. השליכו את הסופרנטנט.
8. הוסף 10 מ"ל טרי של Differentiation Medium עם 0.5 μM RA באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל.
   זהירות: אין לזרום את צברי התאים למעלה ולמטה.
9. זרעו את האגרגטים לצלחת תרבית חדשה בקוטר 100 מ"מ שאינה מטופלת (המוקדשת לתרבית תרחיף).
10. מניחים את הצלחת באינקובטור (ב 37 ° C ו 5% CO₂) במשך יומיים.

2. דיסוציאציה מצטברת

1. שאפו את צברי התאים באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
2. מעבירים את האגרגטים לצינור של 15 מ"ל. אפשרו לצברי התאים לשקוע על ידי כוח הכבידה למשך דקה וחצי.
3. הסר את supernatant.
4. שטפו את האגרגטים עם DMEM בלבד (ללא סרום וללא אנטיביוטיקה).
5. אפשרו לצברי התאים לשקוע על ידי שקיעת כוח הכבידה למשך 1.5 דקות ב-RT.
6. לשאוף את supernatant ולהוסיף 2 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25%).
7. הכניסו את צברי התאים לאמבט מים (37°C) למשך 10 דקות. הניעו את האגרגטים בעדינות כל 2 דקות על ידי הקשה ביד.
8. עצור את תהליך הטריפסיניזציה על ידי הוספת 4 מ"ל של אמצעי תחזוקה.
9. פיפטה את האגרגטים למעלה ולמטה 20 פעמים באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
10. תאי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 200 x g ו- RT.
11. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 5 מ"ל של אמצעי תחזוקה.
12. קבע את מספר התא באמצעות מונה תאים.

3. ציפוי תאים

1. הוסף 3 מ"ל לכל באר של Maintenance Medium לצלחת של 6 בארות.
2. תאי זרעים בצלחת תרבית 6 בארות בצפיפות של 0.5 x 10⁶/well.
3. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם ריכוז_CO2 של 5%.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM גלוקוז גבוה (4.5 גרם / ליטר) עם L-גלוטמין	לונזה	BE12-604Q
אתנול 99.8%	צ'מפור	כימי*613964202
סרום בקר עוברי (FBS)	EURx	E5050-03
פניצילין/סטרפטומיצין 10K/10K	לונזה	DE17-602E
פוספט מלח חוצץ (PBS), מרוכז פי 1 ללא יוני סידן ומגנזיום	לונזה	BE17- 517Q
חומצה רטינואית	סיגמא- אולדריץ'	₪2625-50 מ"ג	מומס באתנול 99.8%; לאחסן ב -20 °C עד 6 חודשים
טריפסין 0.25% - EDTA ב- HBSS, ללא יוני סידן ומגנזיום, עם פנול אדום	ביוסרה	LM-T1720/500
1 מ"ל פיפטות סרולוגיות	פרופילאב	515.01
10 מ"ל פיפטות סרולוגיות	פרופילאב	515.1
צלחת 100 מ"מ ייעודית לתרבית תליה	קורנינג	C351029
15 מ"ל צינורות צנטריפוגות	סיגמא- אולדריץ'	CLS430791-500EA
5 מ"ל פיפטות סרולוגיות	פרופילאב	515.05
צלחת 6 בארות	קורנינג	CLS3516
צלוחיות תרבית תאים, שטח פנים 25 ס"מ רבוע	סיגמא- אולדריץ'	CLS430639-200EA