$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. תרבית פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs)
- הכינו MEF medium, מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM, גלוקוז גבוה), בתוספת 15% נסיוב בקר עוברי (FBS).
- מצפים צלחות תרבית תאים בקוטר 100 מ"מ בתמיסת ג'לטין 0.5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- ספור MEFs באמצעות ציטומטר. הסר את תמיסת הג'לטין ומיד שפך MEF בינוני שחומם מראש ל 37 ° C. הפשיר במהירות בקבוקונים של MEFs מיטומיצין שטופלו C באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ולאחר מכן זרע 2.8 x 106 MEFs לכל צלחת מצופה ג'לטין 100 מ"מ. התאם את מספר התא בהתאם אם אתה משתמש בכלים בגדלים אחרים. יש לדגור על MEFs למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2.
- שנה את המדיום למחרת. תרבית במשך 2-3 ימים עד ששכבת MEF מתמזגת.
2. עכבר תאי גזע עובריים או תרבית ESC
- הכינו מדיום ESC, מדיום דולבקו של איסקוב (IMDM) בתוספת 15% FBS ו-10 גורם מעכב לוקמיה3 U/mL (LIF), 0.1 מילימטר חומצות אמינו לא חיוניות, 55 מילימטר 2-מרקפטואתנול, פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל), גנטמיצין (200 מיקרוגרם/מ"ל) ו-0.2% אנטיביוטיקה מיקופלסמה.
- הסר את מדיום MEF מהצלחת שהוכנה בשלב 1 והחלף אותו בתווך ESC שחומם מראש ב- 37°C.
- הפשיר בקבוקון ESC ותאי זרע על גבי שכבת MEF. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2, עד שתאי גזע עובריים מגיעים למפגש.
- הכינו צלחות תרבית תאים חדשות המכילות שכבה אחידה של MEFs. כדי להעביר את תאי הגזע העובריים, יש לשטוף פעם אחת עם PBS ולנתק עם 0.25% טריפסין/EDTA למשך 2-5 דקות ב-37°C, 5% CO2. עצור את הטריפסיניזציה על ידי הוספת IMDM טרי עם 15% FBS לתאים המתנתקים, העבר את תרחיף התא לצינור 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב 160 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
- הסר את הסופר-נאטנט, השהה מחדש תאי גזע עובריים עם IMDM טרי, והעבר חמישית מהתאים לכל צלחת חדשה מצופה MEF; דגירה עד שהתאים מגיעים למפגש (בדרך כלל 4-5 ימים).
3. משוך MEFs ותאי גזע עובריים בתרבית על צלחות מצופות ג'לטין
- ברגע ש-ECS מגיעים למפגש, נתקו אותם ואת MEFs עם 0.25% טריפסין/EDTA כמו בשלב 2.4, השהו מחדש את התאים ב-IMDM טרי, העבירו לצלחת פטרי בקטריולוגית לא דביקה, ודגרו במשך 40 דקות ב-37°C, 5% CO2.
- העבירו בזהירות תאי גזע עובריים ומדיום המכילים MEF לצלחת חדשה מצופה ג'לטין באמצעות פיפטה של 5 מ"ל, תוך הימנעות מפיפטים חוזרים. התאים שנותרו בצלחות הפטרי הם MEFs מכיוון שתאי גזע עובריים אינם נצמדים.
- מעבר ESCs כל 3-4 ימים. מעברים תכופים פחות עשויים להפחית את ריבוי ESC. אין לחרוג מ -60% מפגש, מכיוון שהוא עשוי להעדיף הבחנה.
- חזור על שלבים 3.2-3.3 שלוש פעמים או יותר, כנדרש, עד שלא ניתן עוד לזהות MEFs במיקרוסקופ תרבית תאים, באמצעות מטרה של 20X, כדי לוודא ש- MEFs אינם נוכחים.
- אמת פלוריפוטנציה של ESC על-ידי בדיקת תרבית ESC כדי לראות אם התאים יוצרים מושבות צפופות עם מורפולוגיה מצולעת ESC טיפוסית (איור 1A). בדיקת גזע התא על-ידי תגובת שרשרת כמותית של פולימראז שעתוק לאחור (qRT-PCR), אימונובלוטינג או אימונופלואורסנציה של גורמי שעתוק פלוריפוטנציה מרכזיים (איור 2).
4. היווצרות EB
- הכן פתרון מלאי all-trans-RA ב 10 mM ב- DMSO ו aliquot אותו לתוך 1.5 מ"ל צינורות microfuge מוגן אור. הפתרון יציב ב -80 ° C למשך עד שבועיים. הגן עליו מפני אור.
- טריפסיניזציה של תאי גזע עובריים כמו בשלב 2.4; לוחית מחדש ב-IMDM טרי ללא LIF כהשעיה של תא יחיד.
- ספור תאים באמצעות המוציטומטר, והכן תרחיף 5 x 105 תאים / מ"ל ב- IMDM עם 0.5 מיקרומטר RA.
- צלחת 100 טיפות 20 μL לכל צלחת פטרי 100 מ"מ עם פיפטה 8 ערוצים ו 200 μL קצוות, להפוך את הכלים, ולמלא את המכסה ההפוך עם PBS כדי למנוע טיפות תלויות להתייבש. הגן על מדיה תרבותית המכילה RA מפני אור.
- תרבית EBs בתלייה טיפות ב 37 ° C, 5% CO2, במשך 4 ימים.
