1. שיבוט של 2K7 Lentivector
- לפני שיבוט הגן המעניין לווקטור הלנטיויראלי 2K7, יש לשכפל את הגן לווקטור pENTR (3637 bp, עמיד לקנמיצין) באמצעות טכניקות מולקולריות סטנדרטיות. השתמש באתרי ההגבלה EcoRI ו- SacII עבור שכפול המשנה.
- הגברה של Lentivector 2K7
- הפוך DNA lentivector 2K7 על ידי ערבוב עדין של 100 ng של DNA פלסמיד עם תאים מתאימים, ודגור על קרח במשך 30 דקות.
- הלם חום DNA / תאים מוכשרים מתערבבים ב 42 ° C במשך 90 שניות וצלחת אותם על לוחות LB-אגר המכילים הן ampicillin (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו chloramphenicol (15 מיקרוגרם / מ"ל) ב 37 ° C במשך 16-18 hr.
הערה: כלוראמפניקול משמש למניעת רקומבינציה בין החזרות הטרמינליות הארוכות.
- למחרת, לגדל שיבוטים חיידקיים נבחרים במדיה Luria-Bertani (LB) המכילה הן ampicillin (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו chloramphenicol (15 מיקרוגרם / מ"ל) ב 37 ° C במשך 16-18 שעות. לחלץ את ה- DNA באמצעות ערכת פלסמיד מסחרית DNA Maxiprep בהתאם להוראות היצרן.
- תת-שיבוט מווקטור pENTR ל-2K7 Lentivector (איור 1).
- הוסף את הדברים הבאים לצינור של 1.5 מ"ל וערבב בעדינות: L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (מקדם) (60 bng)1-2.5 μl L1-L2 pENTR4IRES2GFP (עם גן עניין) (80 bng)1-2.5 μl K7 lentivector (80 ng/μl)1 μl TE-buffer, pH 82-5 μl.Total 8 μl.
- מוציאים את תערובת אנזימי הקלונאז מ-80°C ומפשירים על קרח למשך 2 דקות. ודאו שאנזים זה הוא aliquot טרי מ-80°C-, שכן האנזים הפחית משמעותית את יעילות השיבוט עם מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים
- מוסיפים 2 מיקרוליטר אנזים לכל תגובה ומערבבים היטב דרך מערבולת, ודגרים על תערובת תגובת הקלונאז בטמפרטורה של 23-25 מעלות צלזיוס למשך 6-24 שעות.
- יש להוסיף 1 μl של תמיסת פרוטאינאז K (מסופקת עם ערכת אנזימים) לתערובת תגובת clonase ולדגור במשך 10 דקות ב-37°C.
- הפוך את תערובת תגובת הקלונאז לתאים מתאימים וגדל את המושבות הנבחרות במדיה LB המכילה אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ב 37 ° C למשך 16-18 שעות.
- לחלץ ולטהר DNA באמצעות ערכת פלסמיד DNA Miniprep מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
- אשר את הדנ"א באמצעות עיכול באמצעות אנזימי הגבלה Spe I ו- Sac II ומאגר מתאים בהתאם להוראת היצרן להסיר את המקטע המכיל את המקדם ואת הגן המעניין.
הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לבדוק אם לדנ"א התת-משובט יש את גן ההחדרה הנכון של עניין עם עמוד השדרה הווקטורי הימני. גודל הווקטור עצמו ללא המקטע שהוכנס הוא 6.7 קילובייט. גודל המקטע שהוכנס כולל הן את המקדם והן את גן ההכנסה המעניין. חשב את גדלי המקטעים הצפויים מהעיכול עבור הגן הספציפי באמצעות תוכנית לעריכת רצף DNA, לדוגמה, APE-A Plasmid Editor.
- בדוק את הגדלים הן של עמוד השדרה של וקטור ה- DNA והן של המקטע המשוחרר על ידי הפעלת ג'ל אגרוז 1% במאגר TAE 1x (ראה טבלה 1) ב- 100 V.
- להגביר את ה- DNA המאושר על ידי גידול חיידקים ב 500 מ"ל של מדיה LB המכילה אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ב 37 ° C במשך 16-18 שעות.
- לחלץ ולטהר DNA באמצעות ערכת פלסמיד מסחרית DNA Maxiprep בהתאם להוראות היצרן.
הערה: Maxiprep בדרך כלל מייצר כמות מספקת של DNA הדרוש לייצור ויראלי.
- חזור על שלבים 1.3.9-1.3.10 כדי להגביר את הדנ"א הבא עבור תכשירים לנטי-ויראליים: וקטור מעטפה (PMD2. G, 6.1 קילו-בתים), וקטור חבילה (pBR8.91, 12.5 קילו-בתים), וקטור לנטי-ויראלי ריק כפקד (GFP-CMV-2K7, 8.7 קילו-בתים).
2. ייצור וירוסים 2K7
הערה: יום 1:
- ביום הטרנספקציה, צלחת 32 מיליון תאי HEK293 T בבקבוק T175 המכיל 25 מ"ל כליה עוברית אנושית (HEK) 293 T מדיה התא (ראה טבלה 1). לחלופין, צלחת 16 מיליון תאים ביום שלפני הטרנספקציה אם הזמן רץ חזק ביום הטרנספקציה.
הערה: טרנספקציה יכולה להיות מוצלחת באותה מידה על ידי ציפוי תאים ביום הטרנספקציה או לפני היום. באמצעות כל אחת משתי החלופות, הנקודה הקריטית כאן היא לוודא שהתאים תקועים על פני צלחת התרבית לפני ההעברה.
הערה: יום 2:
- טרנספקציה
- לפני ההעברה, יש לדלל את הדנ"א ל-1 מיקרוגרם/μl במאגר Tris-ethylenediaminetetraacetic acid (TE) המכיל 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8 במים נטולי יונים.
- בשפופרת של 50 מ"ל, הכינו תערובת מאסטר (טבלה 2) להעברה בצלוחית T175. הוסף DNA למדיום הנשר המעובד של דולבקו שחומם מראש (DMEM) וערבב היטב על ידי מערבולת, ולאחר מכן הוסף פוליאתילנימין סטרילי (PEI) (ראה טבלה 1 כדי למנוע משקעים מוקדמים.
- מערבבים היטב על ידי היפוך הצינור 3-4x, ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- בצע שינוי מדיה מלא בתאים HEK293T. יש לשאוף לחלוטין את מצע התרבית מהתאים ולהאכיל בתרבית תאים HEK293T שחוממה מראש (25 מ"ל לכל צלוחיות T175).
- הוסיפו את תערובת הטרנספקציה (תערובת DNA/PEI) בטיפה לתאים החד-שכבתיים. יש לנוע בעדינות כדי לערבב היטב ולדגור על תאים נגועים בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2, למשך הלילה.
הערה: יום 3:
- כדי להבטיח שהטרנספקציה מוצלחת, בדוק את ביטוי החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) 24 שעות לאחר הטרנספקציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערה: מעל 50% מהתאים המבטאים GFP בדרך כלל מצביעים על טרנספקציה טובה.
הערה: יום 4:
- לאחר 48 שעות לאחר הטרנספקציה, אספו את הסופרנאטנט הנגיפי והחליפו אותו במדיה טרייה HEK293 T (25 מ"ל לכל צלוחיות T175).
- צנטריפוגה את הסופרנאטנט הנגיפי ב 1,140 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי לנקות פסולת התא מן supernatant. מעבירים את הסופרנאטנט המפונה לצינור של 50 מ"ל ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4°C.
הערה: יום 5:
- ב 72 שעות לאחר transfection, לאסוף את האצווה השנייה של supernatant ויראלי. חזור על שלב 2.3.1 ובריכה 48 ו 72 שעות ניקה supernatants.
- כדי לרכז את הנגיף, סופרנאטנט נגיפי צנטריפוגה ב 170,000 x גרם במשך 90 דקות ב 4 ° C באמצעות צינורות אולטרה צנטריפוגות 30 מ"ל.
- השליכו את הסופרנאטנט וחזרו על שלב 2.6 עד שכל הסופרנאטנט שנוקה עבר צנטריפוגה והשאירו כדורית (בלתי נראית) של וירוס בתוספת PEI מזורז בבסיס הצינור.
- כדי להשעות מחדש את הנגיף, הוסף מדיה SATO של 500 μl (ראה טבלה 1) לצינורות האולטרה-צנטריפוגה. מערבלים במשך 30 שניות ומגרדים את בסיס הצינור עם קצה פיפטה כדי לשחרר מכנית את הנגיף. חזור על שלב זה 6x על מנת לאבד את הגלולה הנגיפית.
- אגרו את הנגיף המרחף לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות והסתובבו לזמן קצר מאוד כדי להסיר PEI בלתי מסיס. סננו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר חלבונים.
- Aliquot את הנגיף לתוך 20 μl, 50 μl, ו 100 μl aliquots ולאחסן ב -80 ° C.
3. המרת OPC
- OPC ראשוניים בתרבית במדיה SATO (צלחת 10 מ"ל/10 ס"מ) עם גורם נוירוטרופי ריסני (CNTF, 10 נ"ג/מ"ל), גורם גדילה הנגזר מטסיות דם (PDGF, 10 נ"ג/מ"ל), נוירוטרופין 3 (NT3, 1 נ"ג/מ"ל) ופורסקולין (4.2 מיקרוגרם/מ"ל) ב-37°C, 8% CO2 למשך 24 שעות לאחר הדיסקציה.
- שאפו לחלוטין ממדיה של תרבית OPC, והזינו תאים במדיה SATO טרייה (10 מ"ל) עם גורמי גדילה (ראה לעיל בשלב 3.1).
- הוסף וירוס ל- OPC לריכוז האופטימלי, תרבית OPC למשך 48 שעות נוספות.
4. זריעת OPC עבור Myelinating Co-cultures (איור 2)
- כדי להסיר OPC מעל פני השטח, יש לשטוף תחילה את לוחות OPC עם תמיסת מלח מאוזנת (EBSS) של 8 מ"ל של ארל פעמיים, ולאחר מכן לדגור על תאים עם 5 מ"ל של טריפסין-EDTA חם 0.05% מדולל ביחס 1:10 עם EBSS ב-37°C למשך 2 דקות.
- נטרל את הטריפסין עם 30% FBS ב- EBSS (5 מ"ל) והסר תאים מהצלחת על ידי פיפטציה. העבר את מתלה התא לצינור של 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב 180 x גרם למשך 15 דקות ב- RT.
- יש לשאוף מהסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא במדיית SATO שחוממה מראש ב-1 מ"ל ולאחריה ספירת תאים.
- לפני זריעת OPC, שאפו לחלוטין מדיה מצלחת התרבית של DRG. זרעו בעדינות 200,000 OPCs על תאי העצב DRG כפי שתואר קודם לכן.
הערה: נפח הזריעה הכולל של OPC חייב להיות פחות מ-200 μl לכל כיסוי של 22 מ"מ.
- הניחו לתאים לשקוע מבלי להזיז את הצלחת במשך 10 דקות במכסה המנוע של תרבית הרקמה, ולאחר מכן מלאו בעדינות 1 מ"ל מדיה SATO שחוממה מראש לכל באר.
- השב את ה-OPCs האחיות הנותרות עם מדיה SATO עם גורמי צמיחה (ראה שלב 6.1). השתמש ב-OPCs אחיות אלה כדי לאמת את הביטוי של החלבון המעניין.
- לאחר 24 שעות, החלף את מדיית SATO במדיה של תרבית משותפת (2 מ"ל/באר) המכילה מדיה SATO (ללא גורמים) ונוירו-בזאלית (v/v) עם 1% B2שמור על התרביות המשותפות למשך 14 יום עם שינוי מדיה כל 2-3 ימים.
- להעריך את התרביות השיתופיות לביטוי חלבון מיאלין על ידי ניתוח כתם מערבי ולדמיין את היווצרותם של מקטעים אקסונליים מיאלינליים על ידי הכתמה חיסונית כפולה עם נוגדנים כנגד סמני חלבון בסיסיים של מיאלין וסמנים עצביים.
