בידוד תאי עצב המסומנים באופן פלואורסצנטי ממוח מורין

תקציר

מקור: Paul, A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/58690"> ריצוף RNA חד-תאי של נוירונים עכבריים המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות מיון ידני ושעתוק כפול במבחנה עם ריצוף ספירות מוחלטות (DIVA-Seq). J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי עצב המסומנים באופן פלואורסצנטי ממוח עכבר.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. מיון ידני של נוירונים עכבריים המסומנים באופן פלואורסצנטי

1. משוך מיקרו-נימי זכוכית (ראה טבלת חומרים) לקוטר יציאה של 10-15 מיקרומטר באמצעות מושך נימי עם ההגדרות הבאות: חום: 508, משיכה: ריק, וול: ריק, זמן: ריק.
2. חבר צינורות סיליקון גמישים בקוטר 120-150 ס"מ (~0.8 מ"מ בקוטר פנימי) למסנן מזרקים פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) 0.2 מיקרומטר ושסתום צינורות דו-כיווני באמצעות מחברי צינורות מתאימים.
3. הכינו 500 מ"ל של נוזל מוחי מלאכותי מקונן (4°C) שדרתי (ACSF, טבלה 1), וחמצן על ידי בעבוע 5% פחמן דו-חמצני מאוזן חמצן דרך אבן אוויר למשך 15 דקות או עד שהתמיסה תתנקה לחלוטין.
4. הכינו 100 מ"ל של ACSF עם קוקטייל של חוסמי פעילות בכוס של 150 מ"ל (טבלה 1).
5. הכינו 100 מ"ל של ACSF עם פרוטאז IV של 1 מ"ג/מ"ל מקטע סטרפטוקוקוס IV בכוס של 150 מ"ל (טבלה 1).
6. הכינו 100 מ"ל של ACSF עם תמיסת סרום בקר עוברי 1% (FBS) במיכל של 150 מ"ל וחמצן עם 5% פחמן דו חמצני מאוזן חמצן דרך אבן אוויר.
7. נתחו את המוח מעכבר שעבר המתת חסד על ידי פתיחת הגולגולת במספריים קטנים וחילוץ המוח הטרי באמצעות מלקחיים עדינים מבלי לפגוע בקליפת המוח.
   הערה: עכברים מכל זן, גיל ומין יכולים לשמש כרצונם. אין להקפיא את המוח או לבצע מיון ידני בעכברים שהוזרקו להם וירוסים או חומרים מסוכנים/זיהומיים אחרים.
8. שמור על המוח ב- ACSF מקורר ומחומצן, והשאיר אבן אוויר המחוברת ל- 5% פחמן דו חמצני מאזן חמצן במשך כל תקופת החיתוך.
9. מקמו את המוח על צ'אק הוויברטום, חתכו את חלקי העטרה או הקשת בעובי של 300 מיקרומטר. אסוף מקטעים רבים ככל הנדרש כדי להשיג מינימום של ~10-50 תאים מסומנים עד כמה מאות תאים. הניחו פרוסות על מחזיק פרוסות מרושת כותנה, מונחות בתוך כך שהן טובלות ב-ACSF מחומצן.
10. מעבירים פרוסות טריות לכוס המכילה ACSF עם חוסמי פעילות וחוסמים למשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר. המשיכו לבעבע חמצן באמצעות אבן אוויר.
11. העבירו את הפרוסות לכוס המכילה ACSF עם תמיסת פרוטאז לביצוע עיכול עדין בטמפרטורת החדר: 20-30 דקות לבעלי חיים P4-14 או עד 45-60 דקות לבעלי חיים P28-56. המשיכו לבעבע חמצן.
12. שטפו את ACSF עם פרוטאז על ידי הזזת פרוסות חזרה לכוס המכילה ACSF עם תמיסה חוסמי פעילות למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר. המשיכו לבעבע חמצן.
13. העבירו חלקים נפרדים לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה ACSF עם FBS של 1% בטמפרטורת החדר. תחת היקף דיסקציה פלואורסצנטית, אזורים מיקרו-דיסקרטיים ושכבות עניין בעלי מינימום של 10-50 תאים (עד כמה מאות). בצעו את המיקרודיסקציה בעזרת זוג מלקחיים עדינים או על ידי הצמדת מחטי הזרקה 22-28 גרם על מחזיקי עץ (שיפודים).
14. באמצעות פיפטה פסטר, להעביר את חתיכות microdisseced לצינור microfuge 2 מ"ל המכיל ~ 0.8 מ"ל של 1% FBS בתמיסת ACSF.
15. יש לשלש את הרקמה המנותחת בצינור המיקרופוגה בטמפרטורת החדר. הכינו שלוש פיפטות פסטר ארוכות גבעול עם קוטר יציאה הולך ופוחת על ידי גלגולן על להבה פתוחה. בצע ~ 10 פעימות עם כל פיפטה, החל מהגדולה ביותר וכלה בקטנה ביותר.
16. מוציאים את התאים המנותקים לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה ACSF מחומצן (ניתן לצפות את צלחת הפטרי דק ב-5 מ"מ של אגר 1% או תרכובת סיליקון שקופה ביחס של 1:10, אם רוצים). יש לשמור בטמפרטורת החדר.
17. המתן ~ 5-7 דקות עד שהתאים יתיישבו בהדרגה, ולאחר מכן צפה באות GFP / RFP תחת מיקרוסקופ דיסקציה.
    הערה: תאים בודדים, פסולת וגושים קטנים ייראו בשדה בהיר (BF).
18. בחרו 10–15 תאי GFP/RFP בכל פעם באמצעות פיפטה נימית (משלב 1.1) המחוברת לצינורות סיליקון גמישים (קוטר פנימי של 0.4–0.8 מ"מ) ושחררו את התאים לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה ACSF מחומצן טרי.
19. על ידי חסימת קצה שסתום הצינור עם הלשון, מקם את הנימים קרוב לתא המעניין. ללכוד תאים באמצעות פעולה נימית עם הקלה על החסימה, ולחסום במהירות שוב כדי למנוע מנוזל עודף להיכנס לפיפטה. יש לפזר את התאים על צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ עם ACSF מחומצן טרי על ידי נשיפה עדינה, תוך התבוננות בקצה הנימי תחת אופטיקה פלואורסצנטית של מיקרוסקופ הדיסקציה. המטרה היא לאסוף ~ 100-150 תאים בסך הכל.
20. חזור על שלב 1.19 פעם או פעמיים נוספות (תלוי בפסולת) והעבר סך של ~50-75 תאים לצלחת פטרי חדשה בקוטר 100 מ"מ, תוך הקפדה על כך שמזהמים כגון פסולת יהיו מינימליים באופטיקה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות בשדה בהיר (DIC).

טבלה 1: רשימת פתרונות ומאגרים.

מאגר	פריט	ריכוז	כמות (μL)
מאגר איסוף דוגמאות	מעכב ריבונוקלאז רקומביננטי		55
	RCC	1:50K מדולל	110
	מים ללא נוקלאז		605
	Aliquot 43.75 μL של למעלה לתוך 16 צינורות (2 רצועות של 8; 200 μL צינורות PCR); הוסף את הדברים הבאים לכל צינור
	פריימרים של UMI (למשל N10B1-N10B16)	1 נ"ג/μL	6.25 מיקרוליטר/צינור
	נפח סופי בכל צינור 50 μL (ניתן לפצל כל צינור ל-25 μL aliquots ולהקפיא ב-80°C-)
פתרונות:	פריט	ריכוז	כמות
CSF: לגרום ל-5 ליטר להתמוסס	NaCl	126 מ"מ	36.8 גרם
	KCl	3 מ"מ	1.15 גרם
	נה"ה 2ת.ד. 4	1.25 מ"מ	0.75 גרם
	NaHCO3	20 מ"מ	8.4 גרם
	ל 500 מ"ל של ACSF, חמצן מבעבע במשך 10-15 דקות ולאחר מכן להוסיף את הטרי הבא בכל פעם:
	D-גלוקוז	20 מ"מ	1.8 גרם
	מגסו4	2 מ"מ	0.5 מ"ל החל מ 4 M מלאי
	CaCl2	2 מ"מ	0.5 מ"ל החל מ 4 M מלאי
	שמור על ACSF מחומצן עד הסוף
פתרונות:	פריט	ריכוז
קוקטייל חוסם פעילות: הכינו מלאי פי 100
	ל 100 מ"ל ACSF להוסיף
	APV	0.05 מ"מ
	CNQX	0.02 מ"מ
	TTX	0.0001 mM (0.1 μM)
פתרונות:	פריט	כמות
סולציית פרוטאז (100 מ"ל)	פרוטאז מ Streptomyces griseus	100 מ"ג
סרום בקר עוברי: מקור מסחרי, aliquot ב 500 μL לכל שימוש.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DL-AP5	טוקריס	חתול# 0105
CNQX	טוקריס	חתול# 1045
TTX	טוקריס	חתול# 1078
פרוטאז מ Streptomyces griseus	סיגמא-אולדריץ'	Cat# P5147
קרבוגן	איירגז	חתול# UN3156
סילגארד 184	סיגמא-אולדריץ'	חתול# 761036
מיקרוסקופ דיסקציה עם פלואורסצנטיות והארת שדה בהיר עם אופטיקת DIC. (דגם Leica MZ-16F).	לייקה	דגם MZ-16F
מיקרו-נימי זכוכית: צינורות נימי בורוסיליקט 500/pk. OD=1 מ"מ, ID=0.58 מ"מ, קיר=0.21 מ"מ, אורך=150 מ"מ.	מכשירי וורנר	דגם GC100-15, הזמנה# 30-0017
מושך פיפטה נימי	סאטר אינסטרומנטס ושות	P-97
ויברטומה	תרמו-מיקרום	HM 650V
יחידת קירור רקמת ויברטום	תרמו-מיקרום	CU 65