שיטה ליצירת מדיום מותנה אוליגודנדרוציטים

תקציר

מקור: Mazuir, E., et al. דור של אוליגודנדרוציטים ומדיום מותנה אוליגודנדרוציטים לניסויים בתרבית משותפת. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את הייצור של תווך מותנה אוליגודנדרוציטים (OCM) מתאי שושלת אוליגודנדרוציטים על ידי הדגשה שלהם כדי להגביר את שחרורם המולקולרי למדיום. התווך הזה, שעשיר בגורמי גדילה, ציטוקינים ומולקולות ביו-אקטיביות אחרות, יכול להתווסף לתרביות נוירונים כדי לקבל תובנה לגבי ההשפעה של גורמים המופרשים על-ידי אוליגודנדרוציטים על הפיזיולוגיה והקישוריות העצבית.

פרוטוקול

1. שושלת OL (OL) קצירת תאים ותרבית

הערה: יש לבצע שלבים אלה במכסה מנוע זרימה למינרית בתנאים סטריליים.

1. ביום שלאחר הרעידה, הכינו את מדיום Bottenstein-Sato (BS) לפי טבלה 1.
2. שוטפים צלחות פטרי מצופות 3 פעמים במים מזוקקים סטריליים.
3. קצרו צלוחיות סופרנאטנט המכילות בעיקר תאי שושלת OL אך גם כמה תאי מיקרוגליאה והניחו אותו על צלחות פטרי 100 מ"מ לא מצופות.
   הערה: שלב זה מאפשר הסרה של תאי מיקרוגליאה באמצעות הידבקות מהירה דיפרנציאלית על פני המנה.
4. דגרו על צלחות הפטרי במשך 15 דקות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C מתחת ל-5% CO₂.
5. מלאו כל בקבוק T150 ב-25 מ"ל של מדיום תרבית חם וטרי ודגרו באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C מתחת ל-5%_CO2 עד הניעור השני.
6. העבירו את הסופרנאטנט מצלחות הפטרי לצלחות פטרי 100 מ"מ חדשות ללא ציפוי כדי לאפשר היצמדות של תאי מיקרוגליאה שיוריים.
7. דגרו על צלחות הפטרי במשך 15 דקות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C מתחת ל-5% CO₂.
8. מוציאים את הסופרנטנט, המכיל תאי שושלת OL שאינם דבקים, ומעבירים אותו לצינורות 50 מ"ל (סופרנאטנט מ-2 צלחות פטרי לצינור של 50 מ"ל). השליכו צלחות פטרי מצופות מיקרוגליה.
9. צנטריפוגה את supernatant במשך 5 דקות ב 423 x גרם. בזהירות להסיר את supernatant ו resuspend את גלולת התא עם 1 מ"ל של BS בינוני. אסוף את כל הכדוריות בצינור משותף של 50 מ"ל וכוונן את עוצמת הקול ל -10 מ"ל עם BS בינוני.
10. קבע את צפיפות התאים על ידי ספירת תאים תחת מיקרוסקופ.
    הערה: יש לקבל צפיפות תאים בין 3 x 10⁵ תאים/מ"ל ו- 5 x 10⁵ תאים/מ"ל.
11. הוסף 20 מ"ל BS אם צפיפות התאים גבוהה או שווה ל- 4 x 10⁵ תאים/מ"ל כדי לקבל נפח סופי של 30 מ"ל, או הוסף רק 10 מ"ל BS אם צפיפות התאים קטנה מ- 4 x 10⁵ תאים/מ"ל כדי לקבל נפח סופי של 20 מ"ל.
12. צלחת שתיים או שלוש צלחות פטרי 100 מ"מ מצופות מראש עם 10 מ"ל של תרחיף התא. דגירה באינקובטור לח ב 37 ° C תחת 5% CO₂.
13. נקה את הפסולת מצלחות פטרי על ידי רענון כל מדיום BS 2 שעות מאוחר יותר.
    הערה: בחנו את התרבית תחת המיקרוסקופ לפני ואחרי הפינוי כדי לוודא את צפיפות התאים ואת יעילות פינוי הפסולת.
14. דגירה במשך יומיים במדיום BS באינקובטור לח ב 37 ° C תחת 5% CO₂.
    הערה: בחנו את התרבית תחת המיקרוסקופ. המפגש צריך להיות 70% עד 80%.

2. ייצור OCM

NOTE: בצע שלבים אלה במכסה מנוע זרימה למינרית בתנאים סטריליים.

1. הכינו את NB-B27low בינוני לפי טבלה 2.
2. חדש את מדיום התרבית עם 10 מ"ל של מדיום NB-B27low חם. דגירה במשך יומיים באינקובטור לח ב 37 ° C תחת 5% CO₂.
3. קצרו את ה-OCM, כלומר את הסופרנאטנט המכיל גורמים המופרשים ב-OL. סנן-עיקור OCM באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
   הערה: יש לאחסן OCM בטמפרטורה של 4°C למשך חודשיים לכל היותר.

טבלה 1: הכנת מדיה Bottenstein-Sato (BS).

בוטנשטיין-סאטו (BS) מדיה	ריכוז סופי
מדיום הנשר המותאם של דולבקו
פניצילין-סטרפטומיצין	100 יח' בינל'/מ"ל
אפו-טרנספרין אנושי	100 מיקרוגרם/מ"ל
BSA (אלבומין בסרום בקר)	100 מיקרוגרם/מ"ל
אינסולין	5 מיקרוגרם/מ"ל
PDGF	10 נ"ג/מ"ל
פרוגסטרון	62 ננוגרם/מ"ל
פוטרסין דיהידרוכלוריד	16 מיקרוגרם/מ"ל
נתרן סלניט	40 נ"ג/מ"ל
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine נתרן מלח)	30 נ"ג/מ"ל
T4 (ל-תירוקסין)	40 נ"ג/מ"ל

טבלה 2: הכנת מדיה NB-B27low ו-NB-B27.

NB-B27 מדיה נמוכה	ריכוז סופי
נוירובזל
תוסף B27	פי 0.5
ל-גלוטמין	0.5 מ"מ
פניצילין-סטרפטומיצין	100 יח' בינל'/מ"ל
מדיה NB-B27	ריכוז סופי
נוירובזל
תוסף B27	1x
ל-גלוטמין	0.5 מ"מ
פניצילין-סטרפטומיצין	100 יח' בינל'/מ"ל

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוסף B27	תרמופישר	17504044
D-(+)-תמיסת גלוקוז	סיגמא	G8769
מדיום הנשר המותאם של דולבקו	תרמופישר	31966021
אתנול 100%	סיגמא	32221-M
אתנול 70%	VWR כימיקלים	83801.36
סרום עגל עובר	תרמופישר	10082147
נוירובזל	תרמופישר	21103049
פניצילין-סטרפטומיצין	תרמופישר	15140122
פוספט מלח חוצץ ללא סידן ומגנזיום	תרמופישר	A1285601
פוליאתילנימין (PEI)	סיגמא	P3143
בוטנשטיין-סאטו (BS) מדיה
אפו-טרנספרין אנושי	סיגמא	T1147
BSA (אלבומין בסרום בקר)	סיגמא	A4161
מדיום הנשר המותאם של דולבקו	תרמופישר	31966021
אינסולין	סיגמא	I5500
PDGF	פפרוטק	AF-100-13A
פניצילין-סטרפטומיצין	תרמופישר	15140122
פרוגסטרון	סיגמא	P8783
פוטרסין דיהידרוכלוריד	סיגמא	P5780
נתרן סלניט	סיגמא	S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine נתרן מלח)	סיגמא	T6397
T4 (ל-תירוקסין)	סיגמא	T1775
כלים
מסנן 0.22 מיקרומטר	סרטוריוס	514-7010
1 מזרק מ"ל	תרומו	1611127
צלחת פטרי 100 מ"מ	דוטשר	193100
צינור 15 מ"ל	קורנינג מדעי החיים	734-1867
צינור 50 מ"ל	קורנינג מדעי החיים	734-1869
צלחת פטרי 60 מ"מ	דוטשר	67003