הכנת צלחות תרבית ממודרות מצופות קולגן לתרבית תאי עצב

תקציר

מקור: Zepecki, J. P., et al. ניטור בזמן אמת של נדידת תאי גליומה אנושיים בתרביות משותפות של גנגליון שורש גבי, אקסון-אוליגודנדרוציטים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים בניית מערכת תרבית תאים בת שלושה תאים באמצעות קולגן ושומן לא תגובתי. מערכת זו משמשת לצפייה באינטראקציות בין תאי גליומה ואקסונים בזמן אמת.

פרוטוקול

1. תרבית ממודרת של גרעיני שורש הגב של חולדה (DRGs), אוליגודנדרוציטים (OPC) ותאי גליומה אנושיים (hGCs)

1. הכנת מנות תרבות ממודרות

הערה: בצע את השלבים הבאים בימים שלפני הקציר המתוכנן של DRGs.

1. הרכיבו מנות תרבות ממודרות.
2. לדלל תמיסת ציר קולגן ל 500 מיקרוגרם / מ"ל בזיקוק סטרילי H₂O; לערבב היטב.
3. עם פיפטת העברה סטרילית, ממלאים צלחת תרבית בקוטר 35 מ"מ בתמיסת קולגן בקוטר 2 מ"ל; מסירים את התמיסה, משאירים מאחור סרט קולגן דק, ומניחים אותה בכלי הבא בקוטר 35 מ"מ. חזרו על התהליך הזה, הוסיפו עוד תמיסת קולגן לפי הצורך, עד שכל הכלים מצופים.
4. לאחר שכל הצלחות מצופות, הניחו את הצלחות במגש תרבית בגודל 245 מ"מ x 245 מ"מ והניחו שלוש רפידות גזה בגודל 1 מ"מ x 1 מ"מ במרכז המגש.
5. כדי להתפלמר קולגן, רפידות גזה רטובות עם 1 מ"ל של אמוניום הידרוקסיד מרוכז ולכסות את המגשים במשך 15 דקות.
6. הסר את רפידות הגזה ואפשר לכלים בקוטר 35 מ"מ להתייבש במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית.
7. בזמן שהכלים מתייבשים, טוענים את חבית מוליך השומן של המזרק בשומן ואקום גבוה. מניחים את התאים הממודרים בבקבוק מדיה גדול בפה מלא במים מזוקקים. לעקר את שניהם על ידי autoclaving ולאפשר להתקרר.
8. תייקו את הנקודה של מחט 18-G כדי לעשות קצה קהה. לעקר באתנול 70%. חבר את המחט למזרק השומן.
9. לעקר את מגרפת הסיכה על ידי השרייתו באתנול 70%; לאפשר לו להתייבש באוויר במכסה המנוע זרימה למינרית.
10. הסירו את המכסה מתבנית יבשה ומצופה קולגן בקוטר 35 מ"מ. החזק את הצלחת בין האגודל לאצבע המצביע. החזיקו את מגרפת הסיכות ביד השנייה. הפעילו לחץ חזק כדי ליצור אפילו שריטות ברוחב 200 מיקרומטר במרכז המנה.
11. בעזרת פיפטת מרעה, מניחים שתי טיפות של Supplemented Neuronal Basal Medium במרכז השריטות.
12. חזור על שלבים 1.1.10-1.1.11 עד שכל הכלים נשרטו.
13. יבשו את התאים הממודרים במכסה מנוע זרימה למינרי.
14. בעזרת מלקחיים המוסטטיים סטריליים, אחזו בתא ממודר אחד על ידי המחיצה המרכזית. הפכו את המלקחיים ההמוסטטיים כך שתחתית החדר פונה כלפי מעלה.
15. יש למרוח שומן סיליקון על התא המודור, החל מחלקו העליון. ודאו שהשומן מונח בצורה מסודרת וחופף בכל הפינות.
16. הסירו את המכסה מתבנית בקוטר 35 מ"מ. הופכים את התבשיל ומניחים את השריטות מעל החדר. טפחו בעדינות על תחתית הצלחת בעזרת זוג מלקחיים.
17. הפוך בעדינות את הצלחת באמצעות מלקחיים המוסטטיים. שחררו את המלקחיים.
18. מניחים תלולית שומן בבסיס התא המרכזי. מלאו כל תא בתוסף Neuronal Basal Medium (NB) ובדקו אם יש דליפות. אטמו את הנזילות בשומן סיליקון לפי הצורך.
19. המשיכו להרכיב את כל כלי התרבית ואחסנו למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית תאים	קורנינג	430165	35 מ"מ X 10 מ"מ
מחט היפודרמית, 18 גרם	ב.ד.	511097
תמיסת אמוניום הידרוקסיד	פישר סיינטיפיק	A669-500	מרוכז
צלחת תרבית תאים	קורנינג	430165
חדר קמפנוט	טיילר ריסרץ'	קמפ-10
מלקחיים המוסטטיים	רובוז	RS-7035
קולגן חולדה Cultrex I	טרוויגן	3440-100-01
הצמד Rake	טיילר ריסרץ'	קמפ-יח"צ
מדיום נוירובזלי	תרמו פישר	21103049
שומן סיליקון
קובץ מתכת
מגש
גזה
אינקובטור CO2
פיפטה זכוכית