בידוד קפלים עצביים גולגולתיים מעובר אפרוח לצורך תרבית תאי קרסט עצבית

תקציר

מקור: Jacques-Fricke, B. T., et al. הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי קרסט עצביים גולגולתיים. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד קפלים עצביים גולגולתיים מאזור המוח התיכון של עוברי אפרוחים. הוא מציג תהליך דיסקציה מפורט של הקפלים העצביים, מיקומם וחיבורם על כיסויים מצופים פיברונקטין ואחריו תצפית על נדידת תאי הפסגה העצבית מהקפלים העצביים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת פתרונות וחומרים

1. הכן את הפתרון של רינגר על ידי ערבוב 123.3 mM NaCl, 1.53 mM CaCl₂, 4.96 mM KCl, 0.809 mM Na₂HPO₄ ו- 0.147 mM KH₂PO₄ (ראה טבלת חומרים). התאימו את רמת החומציות ל-7.4 וסננו לעקר לבקבוקים של 100 מ"ל. יש לאחסן במקום נקי ויבש. אין לשטוף בקבוקים עם סבון (יש להתייחס אליהם כאל כלי זכוכית לתרבית רקמות).
2. הכן 1 מ"ג / מ"ל תמיסת מלאי פיברונקטין (FN) (ראה טבלת חומרים) על ידי המסת FN בתמיסת רינגר סטרילית ואחסן ב 100 μL aliquots ב -80 ° C (יציב לפחות 4 שנים).
3. הכינו תרבית מלאה על ידי תוספת מדיה L15 עם 0.8% L-גלוטמין, 0.08% פניצילין/סטרפטומיצין, 10% FBS ו-10% תמצית עובר אפרוחים. צור 3 aliquots מ"ל ולאחסן ב -20 ° C או -80 ° C < br / > הערה: אם מודגרים תרביות באינקובטור CO₂, יש להחליף את הנשר הבינוני F12 (DMEM/F12) של דולבקו ב-L15, החוצץ לאוויר.
4. הכן מסגרות תמיכה מנייר סינון (כ-1 ס"מ x 1.5 ס"מ מלבני נייר עם שניים או שלושה חורים מנוקבים חופפים על הציר הארוך).
   1. נקבו חורים לאורך קצה פיסת נייר סינון גדולה באמצעות ניקוב סטנדרטי של שלושה חורים, חתכו/חתכו את הקצה המנוקב לרצועה, ולאחר מכן חתכו את הרצועה בין החורים למלבנים ~ 1.5 ס"מ אורך. ניירות סינון Autoclave לפני השימוש (אופציונלי).
5. אספו כלי נתיחה, כולל מלקחיים עדינים # 3, מלקחיים קהים, מספריים לנתיחה, מספריים קפיציים ומחטי טונגסטן מושחזות.

2. הכנת מנות תרבות

1. בחר צלחות תרבית קיפול עצבי (ראה טבלת חומרים) המתאימות ליישום במורד הזרם.
   1. עבור תרביות שיהיו קבועות ומוכתמות, השתמשו בכיסויי זכוכית שהונחו בצלחות תרבית רקמה מרובות בארות.
      הערה: כיסויים התואמים את גודל הבאר ינועו פחות עם ערבוב נוזלים, מה שהופך את העציצים לפחות נוטים לזוז ונוטים יותר להיצמד לכיסוי ולא לתחתית המנה.
   2. בחרו צלחות חד-קאמריות בעלות תחתית זכוכית או צלחות קאמריות מחולקות (ראו טבלת חומרים) להדמיה חיה במיקרוסקופ הפוך.
   3. להדמיה חיה במיקרוסקופ זקוף או סטריאופוני, יש להשתמש בלוחות תרבית רקמה המתאימים אופטית ל-6, 12 או 24 בארות.
   4. בחר צלחות תרביות רקמת פלסטיק לאיסוף המוני של תאי פסגה עצבית נודדים לניתוחי תפוקה גבוהה.
2. הוסף 10 U/mL של פניצילין ו-10 μg/mL של סטרפטומיצין לבקבוק של 100 מ"ל של תמיסת רינגר סטרילית (לדוגמה, 100 μL של 10,000 U/mL פניצילין ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, כדי ליצור P/S של רינגר). השתמש במכפיל הרווח של Ringer תוך שבוע.
3. הפשיר aliquot של 1 מ"ג / מ"ל של FN על קרח. לדלל עם P/S של רינגר לריכוז של 10-100 מיקרוגרם/מ"ל של FN.
4. Pipet מספיק פתרון FN כדי לכסות את החלק התחתון של הבאר או צלחת. לדוגמה, 100 μL לכל באר צלחת 24 באר, 500 μL עבור צלחת 35 מ"מ.
5. יש להחליף את המכסה ולדגור על כלים או צלחות בתמיסת FN באינקובטור לח (או במגש מכוסה במגבות נייר מזוקקות ספוגות במים) בטמפרטורה של 38°C (100°F) למשך שעה אחת לפחות תוך ניתוח קפלים עצביים.

3. ניתוח קפלים עצביים

1. העבירו את העובר לצלחת נקייה המכילה תמיסת P/S של רינגר ושטפו את העובר על ידי החזקת מסגרת נייר הסינון במלקחיים וסווינג עדין קדימה ואחורה כדי לנקות כל חלמון שמסתיר את שדה הראיה של העובר. החליפו את מכפיל הרווח של הצלצול או העבירו לצלחת טרייה אם הוא נעשה מעונן.
2. מקמו את הצד הגבי/מסגרת של העובר כלפי מעלה תחת מיקרוסקופ מנתח. השארת העובר על מסגרת הנייר כדי לשמור אותו מתוח ומוחזק במקומו, להסיר את קרום ויטלין באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את הקפלים העצביים.
   הערה: אם העובר נופל ממסגרת הנייר, ניתן להניח אותו שטוח בצלחת או להצמיד אותו לצלחת מצופה סילגרד לצורך דיסקציה.
3. באמצעות מספריים קפיץ או מחט טונגסטן מושחזת, בזהירות הבלו את הקפלים העצביים של המוח האמצעי. כללו רקמה קאודלית לשלפוחיות האופטיות המתרחבות ורוסטרל למוח האחורי, שם התכווצויות רומבומרים רק מתחילות להופיע (סהר הלב הוא גם אינדיקטור שימושי, איור 1B, C). שימו לב לכריתת ההיבט הגבי ביותר של הקפל העצבי עם זיהום מינימלי של הצינור העצבי ואקטודרם לא עצבי (איור 1C).
4. מעבירים את הקפלים העצביים לצלחת נקייה המכילה P/S של רינגר באמצעות פיפטור P20 או פיפטה סטרילית מזכוכית פסטר שטופה ב-P/S חלמוני של רינגר (פעולה זו חוסמת את הפלסטיק או הזכוכית כדי למנוע מהרקמה להידבק). אחסנו את הקיפולים שנאספו על קרח תוך ניתוח קיפולים נוספים.

4. ציפוי קפלים עצביים

1. הפשירו אליציטוט של מדיה תרבותית שלמה (סעיף 1, שלב 3). הוסף 100 U/mL של פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין ולסנן סטריליזציה. שמור על מדיה מוכנה בטמפרטורה של 37-38 מעלות צלזיוס בעת ביצוע שלבים אחרים.
2. הוציאו מנות תרבות מהחממה (סעיף 2, שלב 5). בעזרת פיפטור או פיפטה פסטר, הסר את תמיסת FN מכיסויים, כלים או בארות. לאחר שטיפת המצע המצופה FN במכפיל רווח של רינגר, יש להוסיף נפח מתאים של מצע תרבית שלם לכלים או לבארות (500 מיקרוליטר לבארות בצלחת של 24 בארות, 2 מ"ל לצלחת של 35 מ"מ או צלחת של שש בארות).
   הערה: נפחים קטנים יותר יכולים לשמר ריאגנטים יקרים (למשל, עד 200 מיקרוליטר לצלחת של 24 בארות), אך מבטיחים שהמנה תהיה לחה מספיק כדי למנוע אידוי.
3. בעזרת פיפטור p20 או p200, ראשית, שטפו את קצה הפיפטה עם P/S חלמון רינגר כדי לחסום את הפלסטיק ולמנוע מהרקמה להידבק. לאחר מכן, העבירו את הקפלים העצביים המבודדים אל כיסויי ה-FN המצופים, תוך הקפדה על העברת מכפיל רווח קטן ככל האפשר של רינגר. הניחו את הקיפול(ים) לכיוון מרכז הכיסוי המצופה FN.
   הערה: קפל עצבי אחד או כמה קפלים עצביים יכולים להיות מצופים על כיסוי 12 מ"מ בבאר 19 מ"מ, עד 50 על צלחת 35 מ"מ.
4. לאחר שאיפשרתם לצמחים להסתפק במשך 10-15 דקות, הניחו אותם בתא לח בטמפרטורה של 38°C (100°F) על ידי נשיאה איטית וזהירה של כלי התרבית עם קפלים עצביים מצופים. זה ימזער את התזוזה של קפלים עצביים בבארות, ויבטיח שהם יישארו מפוזרים ונצמדים לכל כיסוי.
   הערה: בעת שימוש ב- L15 (לא DMEM), ניתן לדגור גם על צלחות תרבית חצילים באינקובטור ביצים באמצעות מגש מכוסה במגבות נייר לחות.
5. לדגור על תרביות קפל עצבי באינקובטור הלח למשך הנדידה הפעילה (כ-16-20 שעות בסך הכל, איור 2).

תוצאות

איור 1. דיסקציה של קפלים עצביים גביים אפרוח. בעבודה במכפיל הרווח של רינגר, מספריים קפיציים שימשו להסרת קפלים עצביים. (A) מבט גבי עוברי, קדמי לכיוון החלק העליון של האיור. קפלים עצביים נראים אטומים יותר מהרקמה שמסביב. קפלים עצביים של המוח התיכון נמצאים אחוריים לאונות הראייה (ורודות) וקדמיים לסהר הלב (צהוב). (B) מבט גבי על העובר לאחר הסרת קפלים עצביים, המראה גבולות כרית...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AxioObserver מצויד בראש סריקה קונפוקלי LSM710 הנשלט על ידי תוכנת ZEN 3.0 SR	זיס		אלפא משומש Plan-Apochromat 100x/1.46 שמן DIC M27 המטרה
CaCl2	סיגמא-אולדריץ'	C3306
כלים קאמריים (תחתית זכוכית, יחידה או מחולקת)	מאטק; תא ויס	P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis)	תא יחיד 35 מ"מ או 4 תאים 35 מ"מ
כיסוי זכוכית	חברת האספקה הביולוגית של קרולינה	633029, 633031, 633033, 633035, 633037	עיגולים, בעובי 0.13–0.17 מ"מ, זמינים בקוטר 12–25 מ"מ
DMEM/F12	תרמופישר סיינטיפיק	11320033	אלטרנטיבה למדיה L15
אינקובטור ביצים	ספורטאי	1502
פ.ב.ס.	לייף טכנולוגיות	10437-028
פיברונקטין	פישר סיינטיפיק	CB-40008A
נייר סינון	מה איש		כרומטוגרפיה 3MM כיתה
מלקחיים (קהה)	פישר סיינטיפיק; תומאס סיינטיפיק	08-890 (פישר); 1141W97 (תומאס)
מלקחיים (בסדר)	כלים מדעיים משובחים	11252-20	דומונט #5
מחזיק סיכות	כלים מדעיים משובחים	26016-12	למחט טונגסטן (חלופה למספריים קפיציים)
KCl	סיגמא-אולדריץ'	P3911
KH2PO4	סיגמא-אולדריץ'	P0662
מדיה L15	Invitrogen	11415064
ל-גלוטמין	Invitrogen	25030
נא2HPO4	סיגמא-אולדריץ'	S9638
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	S9888
פניצילין/סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות	15140-148	10,000 יחידות/מ"ל פניצילין; 10,000 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין
צלחות פטרי	VWR (או דומה)		60 מ"מ, 100 מ"מ
מספריים (דיסקציה)	כלים מדעיים משובחים	14061-10
מספריים אביביות	כלים מדעיים משובחים	15000-08	קצה חיתוך 2.5 מ"מ (חלופה למחט טונגסטן)
סילגארד	קריידן	סילגארד 184
מסנני מזרקים	סיגמא-אולדריץ'	SLGVM33RS	יחידת מסנן מזרקים Millex-GV, 0.22 מיקרומטר, PVDF, 33 מ"מ, מעוקר גמא
מנות תרבית רקמות	זארשטדט	83-3900	כלי תרבית 35 מ"מ לתרביות קיפול עצבי בתפזורת
חוט טונגסטן	מגוון מקורות		קוטר 0.01 אינץ' למחט טונגסטן (חלופה למספריים קפיציים)