בידוד נוירונים של גנגליון שיווי משקל מהאוזן הפנימית של עכבר

תקציר

מקור: Iyer, M. R. et al., בידוד וטיפוח סומטת גנגליון ווסטיבולרי וספירלי ממכרסמים בילודים להקלטות טלאי.J. Vis. Exp. (2023).

סרטון זה מציג שיטה לבידוד תאי עצב וסטיבולריים מהאוזן הפנימית של גור עכברים. הוא מתאר בקפידה את השלבים הכרוכים בניתוח האוזן הפנימית, קצירת גנגליון שיווי המשקל, ולאחר מכן ניתוק הגנגליון לתאים בודדים. תאים אלה מתורבתים לאחר מכן על צלחות בעלות תחתית זכוכית כדי ליצור תרבית נוירונים וסטיבולרית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנות

הערה: ניתן להכין את הפתרונות והכלים המתוארים בסעיף זה מבעוד מועד ולהשתמש בהם ביום הנתיחה וההקלטה.

1. הכינו מדיה של ליבוביץ בתוספת HEPES של 10 mM (תמיסת L-15). השלבים הבאים מתארים יצירת 1 ליטר של תמיסת L-15.
   1. יוצקים 990 מ"ל של H₂O נטול יונים לתוך אחת. למדוד ולהוסיף 2.386 גרם (10 mM) של HEPES. יש להוסיף בקבוק אחד של 1 ליטר אבקת תמיסת L-15.
      הערה: אבקת L-15 בעלת חיי מדף ארוכים יותר ותופסת פחות מקום אחסון. לחלופין, לרכוש פתרון L-15 ולהשלים עם HEPES. באפשר....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוסף B27 (פי 50), ללא סרום	תרמו פישר סיינטיפיק	17504044	תוספת למדיום תרבות, עבור SGN
כוסות (1000, 100, 10) מיליליטר
צנטריפוגה עם ספסל	ארה"ב סיינטיפיק	2641-0016
מבער בונזן
קולגנאז	סיגמא-אולדריץ'	C5318	אנזים אחד מתוך שלושה לעיכול רקמות
זכוכית כיסוי, מלבנית, #1 עובי, 22x40	וורנר אינסטרומנטס	64-0707
DMSO	ביוטיום	90082
דנאז I,מלבלב בקר	סיגמא-אולדריץ'	11284932001	אנזים אחד מתוך שלושה לעיכול רקמות
Dumont #3 מלקחיים (Blunt)	כלים מדעיים משובחים	11231-30
Dumont #5 מלקחיים (בסדר)	כלים מדעיים משובחים	11251-10
Dumont #55 מלקחיים (בסדר)	כלים מדעיים משובחים	11255-20
אתנול	מעבדות דקון	2716	לניקוי ראש וסביב ספסל דיסקציה
נימי בורוסיליקט נימיים לאלקטרודות	סאטר אינסטרומנטס	BF140-117-10
להב דיסקציה בעל קצוות עדינים	כלים מדעיים משובחים	10010-00
פיפטות פסטר זכוכית	VWR	14673-010	כדי למשוך פיפטות טריטורציה
סרום בקר עוברי מומת בחום	תרמו פישר סיינטיפיק	16140063	תוספת למדיום התרבות
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H3375-100G	לאגירה ברמת החומציות של כל הפתרונות בפרוטוקול
פלטה חמה / בוחשנים מגנטיים	VWR	76549-914
דלי מבודד מלא קרח			כדי לשמור על קרירות כל הדגימות והפתרונות
מספריים קפיציים גדולים	כלים מדעיים משובחים	14133-13
מדיום ליבוביץ	סיגמא אולדריץ'	L4386	פתרונות דיסקציה ואמבטיה
תא הקלטה עם אמבטיה בפרופיל נמוך לצלחות תרבות	וורנר אינסטרומנטס	64-0236
מזרקי Luer-lok, 30 מ"ל	ב.ד.	302832	לציור תמיסת L-15/HEPES/HEPES.
MEM + תוסף גלוטמקס	פישר סיינטיפיק	41-090-101	בסיס המדיום התרבותי
מחט microFil למילוי micropipettes - 34 מד	מכשירים מדויקים בעולם	MF34G
תוסף N2 (100x)	תרמו פישר סיינטיפיק	17502-048	תוסף למדיום תרבות, עבור SGN
NaOH (1 מטר)	תומאס סיינטיפיק	319511-500 מ"ל	עבור pH טיטרציה
חמצן, דרגה רפואית, עם וסת וצינורות נאותים	ניהול חומרים של USC	MEDOX200 (מזהה: 00015)	להתמוססות לתמיסות דיסקציה ואמבטיה
פארפילם	במיס	PM992
נורת פיפטה פסטר (3 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	03-448-25	נורה לפיפטות טריטורציה
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15140122	תוסף למניעת זיהום של מדיום התרבות
תמיסת המתת חסד מבוססת Pentobarbital (למשל, מינון קטלני פלוס 50 – 60 מ"ג/ק"ג)	MWI בריאות בעלי חיים	15199	להמתת חסד
מסנני ממברנות PES , 0.2 מיקרומטר	נלג'ין	566-0020	לפתרונות סינון
מסנני מזרק סטרילי קרום PES, 0.22 אום, 30 מ"מ	CELLTREAT	229747	לתמיסות סינון שנמשכו למזרקים
צלחות פטרי, 35X10 מ"מ	ג'נסי סיינטיפיק	32-103	לדיסקציה זעירה ולהחזקת תמיסת Tip dip בתצורת תיקון מחורר
צלחות פטרי, 60X15 מ"מ	מידלנד סיינטיפיק	P7455	לדיסקציה גסה
מד pH	מטלר טולדו	דגם S20
Pipettors (1000, 200, 10) מיקרוליטר	ארה"ב סיינטיפיק
צלחת תרבית מצופה זכוכית פולי-די-ליזין	מאטק	P35GC-0-10-C	כדי לצלחת נוירונים לתרבית
פלטפורמת החלפה מהירה, בסיס מחומם, לצלחות תרבית 35 מ"מ	וורנר אינסטרומנטס	64-0375
תא הפניה	מכשירים מדויקים בעולם	RC1T
להב אזמל	מילטקס	4-315
ידית אזמל	כלים מדעיים משובחים	10003-12
קנה מידה מדעי	מטלר טולדו	XS64
פיפטות סרולוגיות (10, 25) מיליליטר	פישר סיינטיפיק
ערכת סיליקון גריז (לאיטום זכוכית ותא איטום)	וורנר אינסטרומנטס	64-0378
גיליוטינה של חיות קטנות	קנט סיינטיפיק	DCAP
גיליוטינה של חיות קטנות	קנט סיינטיפיק	DCAP	לעריפת ראשים אם מנתחים חולדות שגילן עולה על P15.
מיקרוסקופ דיסקציה סטריאופוני	זיס	סטמי 2000
מספריים כירורגיים ישרים	כלים מדעיים משובחים	14060-09
מזרק (3, 10, 30) מיליליטר
טריפסין	סיגמא אולדריץ'	T1426	אנזים אחד מתוך שלושה לעיכול רקמות
מזרק שחפת	קובידיאן	8881500105	למתן פתרון המתת חסד על ידי הזרקה intraperitoneal
מספריים קפיציים Vannas, קצה חיתוך 2.5 מ"מ	כלים מדעיים משובחים	15000-08
צלוחיות נפחיות, 1000 מיליליטר
מערבולת	VWR	945300
מים, סטרילי u ltrapure, R>18.18 מגה-Ohms ס"מ (למשל, מסונן על ידי מערכת טיהור מים Millipore-Sigma)	מיליפור-סיגמא	CDUFBI001

עליון