בידוד נוירונים של גנגליון שיווי משקל מהאוזן הפנימית של עכבר

תקציר

מקור: Iyer, M. R. et al., בידוד וטיפוח סומטת גנגליון ווסטיבולרי וספירלי ממכרסמים בילודים להקלטות טלאי.J. Vis. Exp. (2023).

סרטון זה מציג שיטה לבידוד תאי עצב וסטיבולריים מהאוזן הפנימית של גור עכברים. הוא מתאר בקפידה את השלבים הכרוכים בניתוח האוזן הפנימית, קצירת גנגליון שיווי המשקל, ולאחר מכן ניתוק הגנגליון לתאים בודדים. תאים אלה מתורבתים לאחר מכן על צלחות בעלות תחתית זכוכית כדי ליצור תרבית נוירונים וסטיבולרית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנות

הערה: ניתן להכין את הפתרונות והכלים המתוארים בסעיף זה מבעוד מועד ולהשתמש בהם ביום הנתיחה וההקלטה.

1. הכינו מדיה של ליבוביץ בתוספת HEPES של 10 mM (תמיסת L-15). השלבים הבאים מתארים יצירת 1 ליטר של תמיסת L-15.
   1. יוצקים 990 מ"ל של H₂O נטול יונים לתוך אחת. למדוד ולהוסיף 2.386 גרם (10 mM) של HEPES. יש להוסיף בקבוק אחד של 1 ליטר אבקת תמיסת L-15.
      הערה: אבקת L-15 בעלת חיי מדף ארוכים יותר ותופסת פחות מקום אחסון. לחלופין, לרכוש פתרון L-15 ולהשלים עם HEPES. באפשרות השנייה יש גם אפשרות להשתמש בתמיסה נטולת פנול, השימושית להדמיית פלואורסצנטיות.
   2. מערבבים את התמיסה על צלחת ערבוב. באמצעות מד pH, להוסיף לאט 1 N נתרן הידרוקסידי (NaOH) כדי לקבל pH בין 7.34 ל 7.36.
   3. הוסף H₂O שעבר דה-יוניזציה עד שהתמיסה תגיע לנפח של 1,000 מ"ל. סנן את התמיסה באמצעות קרום בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
      הערה: ניתן לאחסן תמיסת L-15 ב 4 ° C למשך 1-2 שבועות. אם משתמשים ב- L-15 המיוצר עם פנול-אדום, התמיסה תהפוך ורודה אם בסיסית מדי (pH > 7.4) או כתומה אם חומצית מדי (pH < 7.34).
2. הכינו את מדיום התרבית עבור נוירוני גנגליון שיווי משקל (VGNs). בצע את השלבים הבאים כדי להפוך 50 מ"ל של מדיום תרבות:
   1. הוסף 47.5 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי GluMAX-I לכוס זכוכית נקייה.
   2. למדוד ולהוסיף 0.1194 גרם (10 mM) של HEPES. חיץ נוסף זה מתנגד לשינויי pH בזמן שהתאים מתיישבים לפני העברתם לאינקובטור.
   3. הוסף 2.5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS). זה עושה 5% על ידי נפח FBS בנפח כולל של 50 מ"ל של בינוני.
   4. מערבבים את התמיסה על צלחת ערבוב. באמצעות מד pH, להוסיף לאט 1 N NaOH כדי לקבל pH בין 7.38 ל 7.4.
   5. הוסף 0.5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין. סנן את התמיסה דרך מסנן סטרילי של 0.22 מיקרומטר. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
   6. לפחות 30 דקות לפני השימוש, העבירו את מצע התרבית לבקבוק תרבית רקמות עם פקק מאוורר. מניחים את הבקבוק עם מדיה תרבית באינקובטור עם ריכוז CO₂ 5% ב 37 ° C.

2. ייצור פיפטות טריטורציה

הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בפיפטות טריטורציה עבור ניסויים מרובים. יש לשטוף את הפיפטות באתנול, מים ותמיסת L-15 לפני כל שימוש ולנקות אותן במים ובאתנול לאחר כל שימוש. יש לאחסן בזהירות בין השימושים.

1. כדי להכין פיפטות טריטורציה לדיסוציאציה של תאים, החזיקו פיפטת פסטר מזכוכית ללהבה של מבער בונזן. ברגע שקצה הזכוכית מתחיל להימס, מתחו את הכוס החוצה לקוטר הקצה הרצוי. משכו קצה אחד של הפיפטה הרחק מהלהבה כדי ליצור כיפוף קטן.
2. קרבו את הפיפטה הכפופה למיקרוסקופ. בעזרת אריח ניקוד, הניקוד ושברו את הזכוכית בקוטר הרצוי.
3. מעבירים את קצה הפיפטה מעל החלק העליון של להבת מבער הבונזן. פעולה זו תלטש במהירות את הקצוות המחוספסים ליד הקצה. בדקו שהקצה אינו אטום על ידי הלהבה.
4. חזור על התהליך עד להכנת ארבע או חמש פיפטות בגדלים שונים.

3. מיצוי גנגליון שיווי משקל וציפוי נוירונים וסטיבולריים

1. הכנה לדיסקציה
   1. הכינו תערובת אנזימים של תמיסת L-15 עם 0.05% קולגנאז ו-0.25% טריפסין. לדוגמה, הוסיפו 0.001 גרם קולגן ו-0.005 גרם טריפסין ל-2 מ"ל של תמיסת L-15 לתוך כד, הוסיפו מערבל מגנטי קטן וערבבו עד לערבוב מלא. מניחים בצד בטמפרטורת החדר.
   2. הכינו גיליוטינה שהושגה באופן מסחרי על ידי הנחת מגבות נייר בצד ומתחת לגיליוטינה כדי למזער את החשיפה של הספסל ומשטחים אחרים לדם ולחומרים ביולוגיים אחרים.
   3. הניחו מספריים גדולים מנירוסטה, מלקחיים גדולים ומספריים קפיציים גדולים. שמור בקבוק תרסיס גדול עם אתנול 70% בהישג יד לניקוי הראש.
   4. מלאו בנפח 100 מ"ל בתמיסת L-15 והניחו אותה על קרח. חמצן את תמיסת L-15.
   5. הניחו את מספריים הקפיץ, מספריים כירורגיים, מלקחיים, אזמל ופיפטת העברה (ראו טבלת חומרים).
   6. הכינו צלחת פטרי 60 מ"מ (לדיסקציה ברוטו) ושתי צלחות פטרי 35 מ"מ (לניקוי/דיסקציה עדינה של הגרעינים). מלאו את הכלי בקוטר 60 מ"מ בתמיסת L-15 מחומצנת באמצעות מזרק 30 מ"ל עם קצה מסנן של 0.22 מיקרומטר.
2. המתת חסד, ניקוי ראש והמיסקציה
   1. שקול את הגורים כדי לחשב את המינון המתאים של דילול קטלני פלוס למתן intraperitoneally (~ 0.01 מ"ל לכל 10 גרם).
   2. ברגע שמגיעים למישור עמוק של הרדמה, כפי שמוערך על ידי חוסר תגובה לצביטת הבוהן, ערפו את ראשו באמצעות הגיליוטינה.
   3. יש לשטוף את הראש ביסודיות עם אתנול 70% ולאחר מכן ביסודיות עם תמיסת L-15.
   4. להסיר לחלוטין את העור מן הגולגולת. חתכו את הראש באמצעות מספריים קפיציות גדולות על ידי התחלה בנקודת הכניסה של חוט השדרה למוח וביצוע שני חתכים, הראשון חתך דרך החלק העליון של הגולגולת והשני דרך החלק התחתון של הלסת. סיים לחתוך את הראש באמצעות מספריים כירורגיים.
   5. הניחו את שני חצאי המוח של הראש בצד כלפי מטה בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ מלאה בתמיסת L-15. הניחו את הרקמה הטרייה שאינה מנותחת כרגע על קרח.
3. חילוץ גנגליון שיווי המשקל העליון
   1. גרפו את המוח בעזרת מספריים כירורגיים סגורים. לנתק ולהסיר את עצב הגולגולת כדי לנתק לחלוטין את המוח מהגולגולת.
      הערה: בשלב זה, הקפסולה האופטית (בצורת הספרה 8) אמורה להיות גלויה בחלק האחורי של הראש.
   2. בעזרת מלקחיים ומתחילים בחלק האחורי של הראש, מושכים חומר קרום שקוף.
   3. חותכים את החלק העליון של הגולגולת החוצה באמצעות מספריים כירורגיים. הסר רקמות עודפות מהחלק האחורי של הראש והצוואר כדי להפוך את אזור הדיסקציה ואת הקפסולה האופטית לנקיים יותר וקלים יותר לגישה.
      הערה: הימנע מהפיכת המנה לעכורה מדי על ידי השלכת רקמות עודפות לאורך כל ההליך.
   4. מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי שנייה עם תמיסת L-15 טרייה. אתר את הקפסולה האופטית ואת עצבי שיווי המשקל השמיעתיים, העליונים ועצבי שיווי המשקל הנחותים. חותכים את עצב השמיעה ומפרידים את הגרעינים העליונים והנחותים באמצעות מספריים קפיציים קטנים.
      הערה: למרות שהסומטה של עצב שיווי המשקל נמצאת הן בגרעינים הנחותים (הדקים יותר) והן בגרעינים העליונים (העבים יותר), לתאים המופקים מהגנגליון העליון יש הישרדות טובה יותר.
   5. בעזרת אזמל, גלחו בעדינות את הרכס הגרמי כדי להחליש את האזור הגרמי שמתחתיו העצב צולל לתוך הקפסולה הגרמית. בזהירות להסיר פסולת עם מלקחיים עדינים, לחשוף את כל החלק הנפוח של הגנגליון.
   6. השתמש במספריים הקפיציים העדינים כדי לגזור ולהפריד את הגנגליון מענף העצבים ההיקפי שצולל לכיוון החדר.
   7. הסר את הגנגליון העליון באמצעות מלקחיים עדינים, הקפד לא לצבוט קרוב מדי לרקמת הגנגליון. מעבירים לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ עם תמיסת L-15 טרייה.
   8. לפני שתמשיך, מחממים מראש את תמיסת האנזים: יוצקים את תערובת האנזימים לצלחת פטרי 35 מ"מ ומניחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
   9. נקו את הגנגליון בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים קפיציים קטנים על ידי הסרת עצם (שנראית לבנה ומגובשת במבנה), רקמה עודפת, סיבי עצב וכל מבנה מיותר אחר. דאג למזער את הסרת כל רקמת גנגליון.
4. דיסוציאציה וציפוי רקמות
   1. מעבירים גרעינים נקיים לתמיסת אנזים שחוממה מראש ומחזירים אותם לאינקובטור למשך 10 עד 40 דקות. הטיפול באנזים מסתיים ברגע שהרקמה מתחילה להתפרק אך נשארת בחתיכה אחת. טיפול יתר ברקמה עם אנזימים יגרום לפירוק מוחלט של הגרעינים לפני טריטורציה.
      הערה: משך הזמן שהרקמה עוברת טיפול אנזימטי תלוי בגיל החיה. לדוגמה, גרעינים מחולדות P9 מטופלים באנזים במשך 25 דקות, וגרעינים מחולדות P15 מטופלים באנזים במשך 35 דקות.
   2. מעבירים את הגרעינים לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ עם תמיסת L-15 טרייה ודגרים למשך 2-3 דקות.
   3. מעבירים את הגרעינים לצלחת פטרי נוספת בקוטר 35 מ"מ מלאה במצע תרבית מסונן.
   4. באמצעות מיקרופיפטה של 200 μL, פיפטה טיפה ~ 150 μL של מדיה תרבית מסוננת על צלחת מצופה זכוכית תחתית. אל תוסיפו יותר מדי תמיסה, שכן חשוב לשמור על מתח הפנים כדי ליצור בועה של תמיסה שנשארת מעל כיסוי הזכוכית.
   5. מעבירים את מספר הגרעינים הרצוי (אחד עד ארבעה) לתלוש הכיסוי.
   6. ציירו כמות קטנה של מדיום תרבית מצלחת התרבית כדי לשטוף את פיפטת הטיריטורציה עם מדיום כדי למנוע מהרקמה להידבק לדפנות פיפטת הזכוכית. טריטורציה על ידי העברה עדינה וחוזרת ונשנית של הרקמה דרך פיפטה עד שהגרעינים מנותקים מספיק.
      הערה: אין להעמיס יתר על המידה על הרקמה כדי לנסות מתלים חד-תאיים או לאפשר לתאים לקרוס לתחתית הצלחת באמצעות לחץ חיובי מוגזם. כמו כן, הימנעו מיצירת בועות אוויר, מכיוון שזה יפחית את הישרדות התא. טריטורציה עדינה היא המפתח להשגת הישרדות מוצלחת של תאים.
   7. תנו לתאים לנוח במשך 5 דקות. בדקו תחת מיקרוסקופ אור אם התאים התיישבו על הכיסוי.
   8. מניחים בזהירות צלחת תרבות לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 12-24 שעות. שוב, הקפד לשמור על בועת התמיסה שלמה.
      הערה: כאשר מטפחים במשך יותר מ-24 שעות, רעננו את אמצעי התרבות מדי יום. זו יכולה להיות נקודת הפסקה אפשרית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוסף B27 (פי 50), ללא סרום	תרמו פישר סיינטיפיק	17504044	תוספת למדיום תרבות, עבור SGN
כוסות (1000, 100, 10) מיליליטר
צנטריפוגה עם ספסל	ארה"ב סיינטיפיק	2641-0016
מבער בונזן
קולגנאז	סיגמא-אולדריץ'	C5318	אנזים אחד מתוך שלושה לעיכול רקמות
זכוכית כיסוי, מלבנית, #1 עובי, 22x40	וורנר אינסטרומנטס	64-0707
DMSO	ביוטיום	90082
דנאז I,מלבלב בקר	סיגמא-אולדריץ'	11284932001	אנזים אחד מתוך שלושה לעיכול רקמות
Dumont #3 מלקחיים (Blunt)	כלים מדעיים משובחים	11231-30
Dumont #5 מלקחיים (בסדר)	כלים מדעיים משובחים	11251-10
Dumont #55 מלקחיים (בסדר)	כלים מדעיים משובחים	11255-20
אתנול	מעבדות דקון	2716	לניקוי ראש וסביב ספסל דיסקציה
נימי בורוסיליקט נימיים לאלקטרודות	סאטר אינסטרומנטס	BF140-117-10
להב דיסקציה בעל קצוות עדינים	כלים מדעיים משובחים	10010-00
פיפטות פסטר זכוכית	VWR	14673-010	כדי למשוך פיפטות טריטורציה
סרום בקר עוברי מומת בחום	תרמו פישר סיינטיפיק	16140063	תוספת למדיום התרבות
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H3375-100G	לאגירה ברמת החומציות של כל הפתרונות בפרוטוקול
פלטה חמה / בוחשנים מגנטיים	VWR	76549-914
דלי מבודד מלא קרח			כדי לשמור על קרירות כל הדגימות והפתרונות
מספריים קפיציים גדולים	כלים מדעיים משובחים	14133-13
מדיום ליבוביץ	סיגמא אולדריץ'	L4386	פתרונות דיסקציה ואמבטיה
תא הקלטה עם אמבטיה בפרופיל נמוך לצלחות תרבות	וורנר אינסטרומנטס	64-0236
מזרקי Luer-lok, 30 מ"ל	ב.ד.	302832	לציור תמיסת L-15/HEPES/HEPES.
MEM + תוסף גלוטמקס	פישר סיינטיפיק	41-090-101	בסיס המדיום התרבותי
מחט microFil למילוי micropipettes - 34 מד	מכשירים מדויקים בעולם	MF34G
תוסף N2 (100x)	תרמו פישר סיינטיפיק	17502-048	תוסף למדיום תרבות, עבור SGN
NaOH (1 מטר)	תומאס סיינטיפיק	319511-500 מ"ל	עבור pH טיטרציה
חמצן, דרגה רפואית, עם וסת וצינורות נאותים	ניהול חומרים של USC	MEDOX200 (מזהה: 00015)	להתמוססות לתמיסות דיסקציה ואמבטיה
פארפילם	במיס	PM992
נורת פיפטה פסטר (3 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	03-448-25	נורה לפיפטות טריטורציה
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15140122	תוסף למניעת זיהום של מדיום התרבות
תמיסת המתת חסד מבוססת Pentobarbital (למשל, מינון קטלני פלוס 50 – 60 מ"ג/ק"ג)	MWI בריאות בעלי חיים	15199	להמתת חסד
מסנני ממברנות PES , 0.2 מיקרומטר	נלג'ין	566-0020	לפתרונות סינון
מסנני מזרק סטרילי קרום PES, 0.22 אום, 30 מ"מ	CELLTREAT	229747	לתמיסות סינון שנמשכו למזרקים
צלחות פטרי, 35X10 מ"מ	ג'נסי סיינטיפיק	32-103	לדיסקציה זעירה ולהחזקת תמיסת Tip dip בתצורת תיקון מחורר
צלחות פטרי, 60X15 מ"מ	מידלנד סיינטיפיק	P7455	לדיסקציה גסה
מד pH	מטלר טולדו	דגם S20
Pipettors (1000, 200, 10) מיקרוליטר	ארה"ב סיינטיפיק
צלחת תרבית מצופה זכוכית פולי-די-ליזין	מאטק	P35GC-0-10-C	כדי לצלחת נוירונים לתרבית
פלטפורמת החלפה מהירה, בסיס מחומם, לצלחות תרבית 35 מ"מ	וורנר אינסטרומנטס	64-0375
תא הפניה	מכשירים מדויקים בעולם	RC1T
להב אזמל	מילטקס	4-315
ידית אזמל	כלים מדעיים משובחים	10003-12
קנה מידה מדעי	מטלר טולדו	XS64
פיפטות סרולוגיות (10, 25) מיליליטר	פישר סיינטיפיק
ערכת סיליקון גריז (לאיטום זכוכית ותא איטום)	וורנר אינסטרומנטס	64-0378
גיליוטינה של חיות קטנות	קנט סיינטיפיק	DCAP
גיליוטינה של חיות קטנות	קנט סיינטיפיק	DCAP	לעריפת ראשים אם מנתחים חולדות שגילן עולה על P15.
מיקרוסקופ דיסקציה סטריאופוני	זיס	סטמי 2000
מספריים כירורגיים ישרים	כלים מדעיים משובחים	14060-09
מזרק (3, 10, 30) מיליליטר
טריפסין	סיגמא אולדריץ'	T1426	אנזים אחד מתוך שלושה לעיכול רקמות
מזרק שחפת	קובידיאן	8881500105	למתן פתרון המתת חסד על ידי הזרקה intraperitoneal
מספריים קפיציים Vannas, קצה חיתוך 2.5 מ"מ	כלים מדעיים משובחים	15000-08
צלוחיות נפחיות, 1000 מיליליטר
מערבולת	VWR	945300
מים, סטרילי u ltrapure, R>18.18 מגה-Ohms ס"מ (למשל, מסונן על ידי מערכת טיהור מים Millipore-Sigma)	מיליפור-סיגמא	CDUFBI001

עליון