בידוד וטיפוח תאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים מקליפת המוח של גור עכבר

תקציר

מקור: Sinyuk, M., et al. דיסקציה ובידוד של גליה מורין מאזורים מרובים במערכת העצבים המרכזית. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (OPC) מקליפת המוח של גור העכבר.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. דיסוציאציה של רקמות

הערה: כל ההליכים הבאים מתבצעים בארון בטיחות ביולוגית בתרבית רקמה סטרילית המיועד לבטיחות ביולוגית בטכניקה אספטית ובחומרים סטריליים.

1. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין המכיל 0.53 mM EDTA לכל צינור חרוטי 15 מ"ל של 9 מ"ל DMEM ורקמה כדי להתחיל ליזה רקמתי.
   הערה: DMEM מכיל כמות גבוהה של סידן כלורי, אשר יכול לפעול כמעכב של טריפסין. אם הדיסוציאציה אינה מלאה בעקבות השלבים המתוארים, ניתן להשתמש בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס ללא סידן או מגנזיום. לאחר טריפסיניזציה, ניתן לנטרל את האנזים על ידי הוספת מעכב טריפסין, אם כי יש להוסיף סידן בחזרה לתמיסה מכיוון שהוא קופקטור עבור DNase I, המשמש בשלבים הבאים.
2. Triturate עם פיפטה 10 מ"ל בערך 20x.
3. העבר את מתלי התא לצינורות חרוטיים ריקים של 50 מ"ל.
4. יש לדגור על התמיסה בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ למשך 15 דקות, ולעורר בעדינות את הליזטים לאחר 8 דקות.
5. הוסף 5 מ"ל של MGM ו- 200 μL (5 מ"ג / מ"ל) DNase I לכל צינור לקבלת ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל.
6. Triturate כל lysate עם פיפטה 10 מ"ל 10x.
7. הניחו למתלי התא לשבת במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לרקמה לא מנותקת להתיישב בתחתית הצינורות.
8. העבר את מתלי התאים לצינורות חרוטיים חדשים של 50 מ"ל, תוך השארת הרקמה הלא מנותקת.
   הערה: שלבי הליזה והטריטורציה שתוארו לעיל מגבילים באופן משמעותי את כמות הרקמה הלא מנותקת.
9. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C ללא בלימה.
10. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את כדורי התא הנותרים ב-5 מ"ל של MGM.
11. Triturate את הגלולה עם פיפטה 5 מ"ל 20x.
12. לוחים את מתלי התאים בנפח 5 מ"ל על צלוחיות T25 מצופות.
13. לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO₂ ולשנות מדיה בתחילה לאחר 24 שעות כדי להסיר פסולת התא.
    הערה: פרוטוקולים מסוימים ממליצים על שינוי מדיה ראשוני לאחר 72 שעות. אופטימיזציה של שלב זה עשויה להידרש.
14. בצע שינוי מדיה של 100% עם MGM כל 48-72 שעות עד שהתאים נפגשים ב-80% (כ-5-7 ימים).
    הערה: יש לחמם את כל חומרי ההדפסה ל-37°C לפני החלפת חומרי המדיה.

2. בידוד תאים מבשר אוליגודנדרוציטים

בעת ציפוי OPC לאחר בידוד ראשוני, יש לצפות אותם על משטח מצופה פולי-D-ליזין (צלחת סטרילית או כיסוי). הכן חומרים אלה לפני השלמת סעיף זה.

1. לאחר 15 שעות טלטול, מוציאים את הסופרנאטנט מהצלוחיות והצלחת על צלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ"מ.
2. יש לדגור על הסופרנאטנט בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ למשך 30 דקות, ולערבל לאחר 15 דקות כדי להסיר את שאריות תאי מיקרוגליה, מכיוון שאלו יידבקו מהר מאוד למנה. ניתן להשתמש בשלב זה בצלחות פטרי שאינן מטופלות בתרבית רקמות.
3. יש להסיר את הסופרנאטנט של התאים שאינם נדבקים, לספור ולצלוף על משטח מצופה פולי-D-ליזין. בדרך כלל, 7,500-10,000 OPC מצופים / ס"מ².
4. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ למשך שעה אחת לפחות (עד 6 שעות), ולאחר מכן לשאוף בעדינות 95% מהמדיה, ולהוסיף לאט לאט OPC Media, תוך הצמדת המדיה לדופן הבאר כדי למזער את ההפרעה של OPC. שנה מדיה כל 48 שעות עד שהתאים מוכנים לשימוש.
   הערה: זה קריטי שרק באר אחת תשתנה בכל פעם. OPC רגישים ורגישים במיוחד לתנאי יובש. התוספת של PDGF-AA במדיה OPC היא לעכב את הבשלת OPC לאוליגודנדרוציטים. גורם זה עשוי להיות מחוץ למדיה תרבית אם מוקד הניסוי הוא oligodendrocytes בוגרים.

טבלה 1: מתכוני מאגר ומדיה.

Mixed Glia Media (MGM)

88 מ"ל	1X DMEM (גלוקוז גבוה, עם L-גלוטמין, עם פירובט Na)
10 מ"ל	FBS מומת חום
1.0 מ"ל	ל-גלוטמין (100X)
1.0 מ"ל	אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית

OPC Media (50mL)

49 מ"ל	מדיה נוירובזאלית
1.0 מ"ל	תוסף B27 (50X)
10 נ"ג/מ"ל	PDGF-AA
הערה: PDGF-AA מתווסף טרי לפני כל שינוי מדיה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.05% טריפסין ו- 0.53 mM EDTA	גיבקו	25300054	דיסוציאציה של רקמות
1X PBS pH 7.4	גיבקו	10010031	מגיב סטנדרטי
50 מ"ל, בקבוק תרבית תאים בגודל 25 ס"מ מרובע	גריינר ביו-וואן	690 175	בקבוק תרבית תאים (T25)
אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית 100X	גיבקו	15240-096	רכיב מדיה
תוסף B-27 פי 50	גיבקו	17504-044	רכיב מדיה
אלבומין בסרום בקר	סיגמא	A9647-50G	דילול נוגדנים
DMEM (1X), גלוקוז גבוה עם Na pyruvate	גיבקו	11995040	רכיב מדיה
דנאז I	סיגמא	10104159001	דיסוציאציה של רקמות
חום סרום בקר עוברי מושבת	גיבקו	A3840001	רכיב מדיה
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (עם Ca או Mg)	תרמופישר	14170120	דיסוציאציה של רקמות
ל-גלוטמין, 200mM	גיבקו	20530081	רכיב מדיה
נוירובזל	גיבקו	21103-049	רכיב מדיה
סרום עיזים רגיל	סיגמא	G9023	רכיב פתרון חוסם
פולי-די-ליזין 12 מ"מ #1 כיסוי זכוכית גרמני	קורנינג ביוקוט	354086	דבק בתא