טכניקה ליצירת אורגנואידים במוח מתאי גזע עובריים אנושיים

תקציר

מקור: Boisvert, E. M., et al. שיטה סטטית מכוונת עצמית ליצירת אורגנואידים במוח מתאי גזע עובריים אנושיים. J. Vis. Exp (2020).

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת אורגנואידים מוחיים מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs). התרבית הדבקה של מושבות תאי גזע עובריים עובריים מטופלת באנזימים כדי לנתק ולפרק אותם לאשכולות. צבירים אלה יוצרים כדורים תלת-ממדיים בהשעיה, אשר לאחר מכן מושרים להתמיין לאורגנואידים המחקים את קליפת המוח עם שכבות של תאי עצב ותאי גלייה.

פרוטוקול

1. תחזוקת תאי גזע

1. שמור על H9 hESCs על שכבה של מטריצת קרום מרתף מופחתת גורם גדילה (ראה טבלת חומרים, מעתה פשוט תיקרא מטריצה) בהתאם להוראות היצרן.
   1. כדי לצפות צלחת אחת בעלת 6 בארות או צלחת אחת בקוטר 10 ס"מ, שלבו 100 מיקרוליטר מטריצה עם 5.9 מ"ל של מדיית Eagle medium (DMEM)/F12 קרה כקרח של Dulbecco. עטפו את הצלחות בסרט פרפין ואחסנו למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. השתמשו בהן למחרת להעברת תאים לאחר שאיפת עודפי המטריצה/מדיה.
2. תרבית את התאים משבוע לשבוע ביחס פיצול של 1:12 בערך כל 7 ימים. שמור על התאים באמצעות מדיה mTESR-1 באינקובטור חמצן נמוך של 37°C (5% O₂, 5% CO₂). רענן מדיה מדי יום. לנכש תאים מבדילים מהתרבית בין מעברים באמצעות כלי זכוכית.
3. תאי H9 צריכים לעבור ארבעה עד שישה ימים לפני השימוש בהם לייצור אורגנואידים. התאים צריכים לעבור ביחס של 1:8 בקירוב של צבירי תאים. כדי לעשות זאת, התחל על ידי שטיפת התאים עם תערובת הנשר הבינוני / מזין שונה של Dulbecco F-12 (DMEM/F12) מדיה לנתק את התאים עם פרוטאז נייטרלי (למשל, dispase, להלן פשוט פרוטאז), לשטוף עם DMEM / F-12, צלחת כמו 30-60 אשכולות תאים על פני 4 לוחות (6-באר או 10 ס"מ) ב ~ 20% מפגש. יומיים לפני הקציר מעבירים אותם לאינקובטור רגיל (21% O₂, 5% CO₂). לוחות צריכים להגיע ~ 80% מפגש בעת תחילת היווצרות אורגנואידים.

2. דיסוציאציה של תאי גזע עובריים לתרבית אורגנואידים

1. Aliquot פתרון מלאי פרוטאז (5 U/mL).
   הערה: אנחנו בדרך כלל להקפיא 1 מ"ל aliquots ב -20 ° C לשימוש במשך מספר חודשים.
2. דלל את תמיסת מלאי הפרוטאז לריכוז העבודה על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת המלאי בתוספת 5 מ"ל של DMEM/F12 עבור כל צלחת של 6 באר או 10 ס"מ של תאי גזע עובריים.
3. שאפו והסירו את מדיית תרבית התא, ולאחר מכן כסו את תאי הגזע עובריים עובריים בתמיסת פרוטאז. מניחים צלחות באינקובטור למשך 10-15 דקות או עד ששולי המושבות מתעגלים כלפי מעלה ומתחילים להיפרד מהמטריצה.
4. הטו את הצלחת, שאפו את תמיסת הפרוטאז ושטפו בעדינות את התאים עם DMEM/F12 שלוש פעמים. יש להשתמש ב-2 מ"ל/באר לכל שטיפה בעת שימוש בצלחת בעלת 6 בארות ו-6 מ"ל בעת שימוש בצלחת בקוטר 10 ס"מ. ודא שהמושבות נשארות מחוברות למטריצה בעת ביצוע שלב זה.
5. הוסיפו בחזרה כ-1.5 מ"ל של מדיית mTESR טרייה לכל באר (או 5 מ"ל עבור צלחת של 10 ס"מ) ושטפו את התאים מהצלחת באמצעות פיפטינג עדין.
6. בעזרת פיפטה של 10 מ"ל, שאפו בעדינות ופזרו hESC בתוך הצלחת עד שהם מגיעים לכ-1/30 מגודלם המקורי. אשכולות מושבות צריכים להידמות לריבועים בגודל ~ 250-350 מיקרומטר בהשלמת שלבים אלה.

3. דור האורגנואידים

1. העברת תאים לבקבוק חיבור T75 יחיד בעל חיבור נמוך במיוחד המכיל 30 מ"ל של מדיה mTESR ללא גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF).
2. למחרת, הטו את הצלוחיות כך שהתאים החיים יתאספו בפינה (זה עשוי לקחת 5-10 דקות ביום הראשון, אך יהיה מהיר יותר ככל שהאשכולות יגדלו).
   הערה: אם יש מספר רב של תאים שנצמדו לתחתית הבקבוק בשלב זה או בכל השלבים הבאים, העבירו את התאים לצלוחית חדשה. זה נורמלי שיש אוכלוסייה גבוהה של תאים מתים במשך היומיים הראשונים. בעת ביצוע שינויי מדיה, הקפד להסיר כמה שיותר מפסולת התא.
3. ברגע שהתאים מתיישבים, שואפים מהמדיה ומהתאים המתים, ומשאירים כ -10 מ"ל של מדיה המכילה את התאים החיים.
4. הוסף ~20 מ"ל של מדיה נמוכה bFGF (DMEM/F12 בתוספת 1x N2, 1x B27, 1x L-גלוטמין, 1x חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 0.05% אלבומין בסרום בקר (BSA), ו 0.1 mM monothioglycerol (MTG) בתוספת 30 ng/mL bFGF).
5. בדוק את התאים ביום השני. אם רוב התאים נראים בריאים ובהירים, אין צורך לעשות דבר. עם זאת, אם יותר משליש מהתאים נראים כהים, החלף את המדיה (באותה טכניקת הטיה כמו בשלב 3.2) ב~20 מ"ל של מדיה bFGF נמוכה בתוספת 20 ng/mL bFGF.
6. ביום השלישי, החלף מחצית מהמדיה (באמצעות טכניקת ההטיה בשלב 3.2) ב- 20 מ"ל של מדיה bFGF נמוכה בתוספת 10 ננוגרם/מ"ל bFGF.
7. ביום 5, החלף מחצית מהמדיום (באמצעות טכניקת ההטיה בשלב 3.2) ב- 20 מ"ל של מדיה אינדוקציה עצבית (NIM: DMEM/F12, תוסף N2 1x, 0.1 mM MEM NEAA, 2 מיקרוגרם / מ"ל הפרין).
   הערה: אם יש אשכולות גדולים של תאים או אורגנואידים שהם הרבה יותר גדולים מהאחרים, יש להסיר אותם מהתרבית. הגודל מוערך על ידי המראה מתחת למיקרוסקופ; לדוגמה, באמצעות עינית עם רטיקל. רוב האורגנואידים הם בגודל דומה (בערך 100 ± 20 מיקרומטר). הסרנו אורגנואידים שהיו קטנים או גדולים בערך פי 2 מהאחרים.
8. החלף מחצית מהמדיום (~ 15 מ"ל) (באמצעות טכניקת הטיה) ב- NIM פעם ביומיים.
9. לאחר 3 שבועות בתרבית, יש להוסיף 100x פניצילין/סטרפטומיצין למדיה (NIM: DMEM/F12, תוסף N2 אחד, 0.1 mM MEM NEAA, 2 מיקרוגרם/מ"ל הפרין) בריכוז סופי של 1x אם רוצים. רענן את המדיה אחת ליומיים.
   הערה: באופן זה, שמרנו על האורגנואידים עד 6 חודשים בתרבית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוסף B27	Gibco, Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, ארה"ב (ארצות הברית)	PHG0263
BSA	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	A9647
דיספסי	STEMCELL Technologies, ונקובר, קנדה	7913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	10010023
גורם גדילה מטריגל מופחת (מטריקס)	קורנינג, קורנינג, ניו יורק, ארה"ב (ארצות הברית)	356231
H9 תאי ESC	WiCell, Madison, WI, ארה"ב (ארצות הברית)	WA09
הפארין	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	9041-08-01
ל-גלוטמין	Gibco, Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	25030-081
מונותיוגיצרול	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	M6145
מדיה mTESR	STEMCELL Technologies, ונקובר, קנדה	85850
N2 נוירופלקס	Gemini Bio Products, ווסט סקרמנטו, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	400-163
NEAA	Gibco, Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	11140-050
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב (ארצות הברית)	T8787-100ML
צלוחיות T75 עם חיבור נמוך במיוחד	קורנינג, קורנינג, ניו יורק, ארה"ב (ארצות הברית)	3814