1. דיסקציה של המוח התיכון הגחוני וחוט השדרה
הערה: בצע את כל השלבים הבאים למעט שלבים 1.1.1−1.1.3 ו- 1.1.5−1.1.6 תחת סטריאומיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטית. זמן הדיסקציה הכולל לניסוי הוא בדרך כלל 3-5 שעות, תלוי במיומנות בטכניקת הדיסקציה ובמספר הנוירונים המוטוריים הדרושים לכל ניסוי.
- דיסקציה של המוח התיכון הגחוני
- המתת חסד של עכברה בהריון כ-11.5 ימים לאחר ההפריה על ידי גז פחמן דו חמצני ונקע צוואר הרחם.
- רססו היטב את הבטן באתנול והוציאו את הרחם באמצעות מספריים סטריליים לניתוח מיקרו ומלקחיים לחבישת האגודל. שטפו את הרחם לזמן קצר במי מלח סטריליים חוצצים פוספט (PBS), ולאחר מכן העבירו לצלחת הדיסקציה המלאה ב-PBS סטרילי מצונן.
- הסר את העוברים החיוביים של IslMN:GFP (Islet motor neuron: green fluorescent protein) בזהירות מהרחם באמצעות מספריים סטריליים לניתוח מיקרו, מלקחיים לחבישת אגודל ופינצטה Dumont #5 במי מלח סטריליים קרים כקרח (PBS) תחת האור הבהיר של המיקרוסקופ. בעזרת כף מחוררת קטנה סטרילית של מוריה, מעבירים כל עובר לבאר נפרדת של צלחת 24 בארות מלאה במדיום פלואורסצנטי נמוך Hibernate-E מצונן בתוספת 1x B27. שומרים את צלחת 24 הבאר על קרח.
- מעבירים עובר אחד לצלחת דיסקציה סטרילית ומכסים אותו לחלוטין בתמיסת מלח סטרילית קרה כקרח של האנק (HBSS).
- ודא כי שלבי הדיסקציה מבוצעים תחת הארה פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) של המיקרוסקופ. בעזרת פינצטה הסירו את הזנב ואת פני העובר מבלי לפגוע במוח התיכון (איור 1Ba). הניחו את העובר עם גפיים קשורות מתחתיו וזנב מכוון לכיוון קדמת המיקרוסקופ, לכיוון הדיסקציה (מסומן בכוכבית, איור 1Bb).
- בעזרת פינצטה חותכים את גג החדר הרביעי על מנת ליצור פתח קטן. השתמשו בפתח זה כדי לחבר פינצטה לחלל שנוצר בין החדר הרביעי לגגו. חתכו לאורך פני השטח הגביים של רוסטרל העובר אל קליפת המוח ולרוחב אל לוחית הרצפה והעמוד המוטורי (איור 1Ca,b). פתח את הרקמה המנותחת באופן ספר פתוח כדי לחשוף את הנוירון האוקולומוטורי החיובי ל- GFP (עצב גולגולתי 3 [CN3]) ואת הנוירון הטרוכליארי (עצב גולגולתי 4 [CN4]) גרעינים.
הערה: חתיכה קטנה של רקמה מהמוח התיכון הגחוני המכילה מזנכימה, CN3 ו-CN4 תיחשף כעת.
- יש להפריד בזהירות את המוח התיכון הגחוני מהעובר ולהסיר את רקמת קרום המוח באמצעות פינצטה וסכין מיקרו לניתוח. נתחו את גרעיני CN3 ו-CN4 הדו-צדדיים החיוביים ל-GFP הרחק מלוח הרצפה ומרקמות אחרות הסובבות GFP שלילי באמצעות פינצטה וסכין מיקרו לניתוח (איור 1D). למקסם את מספר הנוירונים המוטוריים החיוביים ל-GFP ברקמה שנכרתה, אך הימנעו מלגעת בהם או לפגוע בהם.
- אם רוצים אוסף של גרעיני CN3 ו-CN4 נפרדים, חתכו לאורך קו האמצע של שני הגרעינים האלה (קו צהוב מקווקו באיור 1D). באמצעות פיפטה P1000, לאסוף את רקמת המוח התיכון הגחוני מנותח עם HBSS מינימלי ולהניח אותו בתוך צינור microcentrifuge מסומן 1.7 מ"ל מלא בתווך דיסקציה. יש לאחסן על קרח עד לדיסוציאציה.
- המשך איגום המוח התיכון הגחוני מעוברים נוספים באותו צינור עד שהמספר הכולל יעמוד בדרישת הניסוי (עיין בשלב 4 לקבלת מספרי תאים אידיאליים).
הערה: מומלץ לאסוף אוסף של לפחות 10 מוחות אמצעיים גחונים המניבים בערך 1 x 104 נוירונים מוטוריים CN3/CN4 מכיוון שהרקמות נתונות ללחץ במהלך הדיסוציאציה והמיון.
- דיסקציה של חוט השדרה הגחוני
- שמור על העובר נוטה כשהראש פונה לקדמת המיקרוסקופ, לכיוון הדיסקציה. החזיקו את העובר עם זוג פינצטה אחד והכניסו את קצה זוג הפינצטה השני לחלק הקאודלי הלא פתוח של החדר הרביעי.
- פתח את שאר המוח האחורי וחוט השדרה באופן דורסלי על פני כל ההיקף הרוסטרוקאודלי של העובר. פתח על-ידי חיתוך רקמה גבית, החל מהחדר הרביעי ועבודה לכיוון התעלה המרכזית של חוט השדרה הקאודלי באמצעות המלקחיים כמספריים (איור 1Ca,b). יש להקפיד להימנע מלגעת או לפגוע בחוט השדרה הגחוני במהלך הליך זה.
- החזיקו את העובר עם זוג פינצטה אחד וצבטו את דש הרקמה הגבית בכל צד עם זוג הפינצטה השני (איור 1Ea,b).
הערה: רקמות גביות שנכרתו מכילות עור גבי, מזנכימה, גרעיני שורש גבי (DRGs), מוח אחורי גבי וחוט שדרה. הסר כמה שיותר רקמות אלה מבלי לפגוע בגרעיני הנוירון המוטורי בעמוד השדרה (SMN), מכיוון שהן דביקות ויכולות ללכוד SMN במהלך סינון או לגרום לסתימה במהלך מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS).
- הסר את חוט השדרה הגחוני באמצעות סכין microdissection כדי לחדור ישירות מתחת SMN חיובי GFP. הרימו את חוט השדרה הגחוני בעזרת תנועות דמויות מסור משני הצדדים (איור 1Fa,b). חתכו את חוט השדרה הגחוני הצף לרוחב ישירות מעל C1, היכן שהקרן הקדמית החיובית הראשונה של GFP מקרינה (איור 1G). כמו כן, חתכו לרוחב בגבול העליון של הגפה התחתונה (איור 1G). הסר את החלק הצווארי-מותני (C1)-מותני (L2-L3) של חוט השדרה הגחוני לאחר הליך זה.
- הניחו את הצד הגבי של חוט השדרה הגחוני כלפי מעלה והחזיקו על ידי לחיצה על הרקמה השלילית GFP בין עמודות SMN חיוביות ל-GFP עם זוג פינצטה אחד. הסירו את שאר המזנכימה, ה-DRG וחוט השדרה הגבי על-ידי חיתוך שני הצדדים של עמודת SMN חיובית ל-GFP עם סכין המיקרודיסקציה (איור 1H). דאגו למקסם נוירונים מוטוריים חיוביים ל-GFP מבלי לפגוע בהם.
- באמצעות פיפטה P1000, יש לאסוף את רקמת חוט השדרה הגחונית המנותחת עם HBSS מינימלי ולהניח בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל המסומן ב-SMN מלא בתווך דיסקציה. יש לאחסן על קרח עד לדיסוציאציה. המשך איגום חוטי השדרה הגחונים מעוברים נוספים באותו צינור עד שהמספר הכולל יעמוד בדרישות הניסוי.
הערה: מומלץ לאסוף לפחות שלושה חוטי שדרה גחונים המניבים כ 2.1 x 104 SMN מכיוון שהרקמות נתונות ללחץ במהלך דיסוציאציה ומיון.
- אספו נוירונים מוטוריים של הפנים והגפיים של עוברי עכבר ISLMN:GFP כבקרות חיוביות ל-GFP ושליליות למיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS), בהתאמה. הגפיים הן שליליות ל-GFP מכיוון שהאקסונים החיוביים ל-GFP של ה-SMN עדיין לא התרחבו לגפיים בגיל עוברי זה.
2. דיסוציאציה של רקמות
הערה: זמן הדיסוציאציה הכולל הוא בדרך כלל 1.5 שעות לכל ניסוי.
- פפאין חם ו אלבומין-ovomucoid מעכב פתרון aliquots ל 37 ° C 30 דקות לפני דיסוציאציה.
- סובב בקצרה למטה רקמות מיקרו מנותחות במהירות נמוכה.
- באמצעות פיפטה P100, בזהירות להסיר כמה שיותר Hibernate E מבלי לשאוף רקמות.
הערה: הקפד להסיר את כל שאריות Hibernate E לאחר שלב זה כדי למנוע הפחתת היעילות של דיסוציאציה פפאין בשלב הבא.
- הוסף את הנפח המתאים של תמיסת פפאין (טבלה 1) לכל אחת מצינורות המיקרוצנטריפוגות בנפח 1.7 מ"ל המכילות את דגימות הרקמה המיקרודיסקטיביות.
הערה: נפח הפפאין המתאים לדיסוציאציה נקבע על מנת למקסם את הדיסוציאציה היעילה תוך מזעור הלחץ על התאים.
- עשו טריטורציה עדינה פי 8 עם פיפטה P200. בצע את כל שלבי הטריטורציה בעדינות כדי לשמר את יכולת הקיום של נוירונים מוטוריים.
- יש לדגור על הצינורות המכילים את הרקמות במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C, ולהתסיס על ידי הזזת אצבע 10x כל 10 דקות. שלשו בעדינות כל תרחיף 8x עם פיפטה P200 לאחר הדגירה. סובב את התאים במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות.
- כדי להבטיח את היעילות של עיכוב ovomucoid בשלב הבא, להשתמש פיפטה P1000 כדי להסיר ולהשליך כמה שיותר supernatant מבלי לשאוף את הרקמות.
- יש להשהות מחדש את הכדוריות בנפח המתאים של תמיסת מעכבי אלבומין-אובומוקואיד (טבלה 1) על-ידי טריטוציה עדינה של 8x עם פיפטה P200.
- המתן 2 דקות כדי לאפשר לחתיכות הנותרות של רקמה לא מנותקת לשקוע לתחתית הצינור.
- אספו כמה שיותר סופרנאטנט מבלי לשאוף רקמות לא מנותקות באמצעות פיפטה P200. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגות טריים בנפח 1.7 מ"ל.
- אם חלק מגושי הרקמה נותרים בלתי מנותקים לאחר שלב 2.10, חזור על שלבים 2.8-2.10 עבור הרקמות הבלתי מנותקות שנותרו בצינורות המיקרוצנטריפוגות המקוריים של 1.7 מ"ל כדי למקסם את התפוקה הסופית של תאים מנותקים תוך מזעור הלחץ על התאים שנותקו קודם לכן, הכלולים בסופרנאטנט של שלב 2.10.
- סובבו את התאים כלפי מטה במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות. הסירו בזהירות את הסופרנאטנט והשליכו אותו באמצעות פיפטה P1000.
- השהה מחדש את הגלולה בנפח המתאים של אמצעי הדיסקציה (טבלה 1) על ידי פיפטציה 8x באמצעות פיפטה P1000. נפח ההשעיה הסופי המתאים נקבע כך שצפיפות התאים לא תעלה על 107 תאים למ"ל, מה שיכול לחסום את זרם מכונת ציטומטריית הזרימה, אך גם כדי שהתאים לא ידוללו יתר על המידה, מה שגורם להאטה במהירות המיון.
- סנן את המתלים דרך מסננות תאים של 70 מיקרומטר כדי לסלק גושים גדולים או רקמות לא מעוכלות. מעבירים את המתלים למבחנות פוליסטירן תחתונות עגולות בנפח 5 מ"ל ומאחסנים על קרח עד לצורך.
3. מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS)
הערה: פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה באמצעות ממיין FACS המצויד בלייזר סגול 15 MW 405 ננומטר, לייזר כחול 100 MW 488 ננומטר, לייזר כתום 75 MW 594 ננומטר ולייזר אדום 40 MW 640 ננומטר. התאים מוינו כנוזל נדן ב-PBS סטרילי בתנאים אספטיים דרך פייה של 100 מיקרומטר. על מנת למזער את העקה התאית, קצב הזרימה הוגדר ללחץ דגימה של 1-3, כך שהושגו מקסימום של 1,000-4,000 אירועים בשנייה. זמן FACS הכולל הוא בדרך כלל 1-2 שעות לכל ניסוי.
- הגדר מתחים לפיזור קדימה וצידית כך שניתן יהיה להמחיש כראוי את אוכלוסיית התא. הגדרת מתחים מתאימים למיון תאים היא מורכבת ודורשת מפעיל FACS מנוסה.
- כדי להבחין בין אוכלוסיות תאים שונות, התווה תאים בהתבסס על גודל כפי שנקבע על-ידי אזור הפיזור הקדמי (FSC-A) לעומת הסיבוכיות הפנימית כפי שנקבע על-ידי אזור פיזור הצד (SSC-A). ציירו שער סביב התאים החיים כפי שמצוין באיור 2Aa ובאיור Ba כדי לסלק פסולת ותאים מתים. קבץ את התאים בתוך האזור המגודר כאוכלוסייה 1 (P1).
- כדי לא לכלול גושים והכפלות של תאים, התווה תאי P1 בשלב הבא בהתבסס על רוחב פיזור הצד (SSC-W) לעומת SSC-A. שער האוכלוסייה של תאים בודדים כאוכלוסייה 2 (P2) (איור 2Ab ואיור Bb).
- התווה תאי P2 בהתבסס על רוחב הפיזור קדימה (FSC-W) לעומת FSC-A ושער את אוכלוסיית התאים הבודדים כאוכלוסייה 3 (P3) (איור 2Ac ואיור Bc).
הערה: שימוש בשני שערים רצופים ב-3.3 וב-3.4 אינו כולל גושי תאים וכפולים (FSC-W גבוה ו-FSC-A גבוה).
- תאי שער P3 המבוססים על GFP לעומת אלופיקוציאנין (APC). ערוץ APC מזהה autofluorescence. Gating על ערוץ זה נמנע לכידת תאים autofluorescent. השתמש בתאים שליליים של GFP כדי להתאים את המתח עבור ערוצים פלואורסצנטיים של FITC/GFP. באופן אידיאלי, מקם שערים עבור אוכלוסיות תאים אלה סביב 102. בחר ספי שער עבור אוכלוסייה 4 (P4) חיובית ל-GFP בנפרד עבור כל סוג של נוירון מוטורי (איור 2Ad ואיור Bd).
הערה: הגדר את שער ה-GFP הרבה יותר גבוה עבור SMN מאשר עבור CN3s/CN4s כדי לקבל תרבית טהורה (איור 2Ad ואיור Bd). שער GFP נמוך יותר עבור תרביות SMN מוביל לזיהום התרביות על ידי גליה ונוירונים לא מוטוריים. סביר להניח שהסיבה לכך היא שיש ביטוי GFP ברמה נמוכה בחלק מתאי הגליה והנוירונים הלא מוטוריים עקב מקדם דולף. אחוז התאים החיוביים ל-GFP בהשוואה לכלל התאים הוא בדרך כלל 0.5-1.5% עבור CN3s/CN4s ו-1.5%-2.5% עבור SMNs. אם הדיסקציה הצליחה, המספרים האלה יכולים לשמש כאמת מידה כדי לקבוע את המיקום המתאים לשער החיובי של GFP (איור 2Ae ואיור Be).
- בצע FACS בהתאם לפרוטוקול היצרן. אספו תאי P4 לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות טריים של 1.7 מ"ל מלאים ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית נוירונים מוטוריים. יש לאחסן על קרח עד לציפוי.
הערה: למרות שניתן למיין את התאים ישירות לבארות, התוצאה היא מספר לא אחיד של תאים לכל באר. מיין את התאים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.75 מ"ל ולאחר מכן צלחת ידנית על מנת להשיג פיזור ציפוי אחיד יותר.
4. תרבית של נוירונים מוטוריים ראשוניים מטוהרים
- דילול מתלי CN3/CN4 ו-SMN מבודדים ב-FAC עם מדיום תרבית נוירונים מוטורית שחומם מראש ל-37°C לצפיפויות של 5 x 103 ו-1 x 104 תאים/מ"ל, בהתאמה.
הערה: עובר E11.5 אחד מניב בערך 1 x 103 CN3 / CN4 ו 7 x 103 SMN. עם זאת, יבולים אלה מסתמכים במידה רבה על טוהר הרקמות המנותחות, היסודיות של דיסוציאציה של תאים, והסף המתאים של שערי GFP במהלך FACS.
- מעבירים 96 צלחות באר מצופות מראש בפולי D-ליזין (PDL) ולמינין מאינקובטור תרביות הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית ושאפו למינין מכל באר. יש להשתמש בצלחות ובכיסויים באופן מיידי ללא שטיפה.
- הוסף 200 μL של מתלי CN3/CN4 ו-SMN מדוללים לכל באר של לוחות 96 בארות מצופות PDL/למינין. צפיפות התאים הסופית צריכה להיות 1 x 103 ו- 2 x 103 תאים/באר עבור CN3/CN4 ו-SMN, בהתאמה.
הערה: צפיפות הציפוי הראשונית של SMN ב-96 צלחות באר (2 x 103 תאים / באר) כפולה מזו של CN3s/CN4s (1 x 103 תאים / באר) על מנת לקבל מספרי נוירונים מוטוריים סופיים דומים וצפיפויות ב 2 ו -9 ימים במבחנה (DIV) (4-6 x 102 ו 2-4 x 102 תאים לכל באר, בהתאמה).
- תאי עצב בתרבית באינקובטור של 37°C, 5% CO2.
- הזינו תאי עצב כל 5 ימים על ידי הסרת מחצית מהמדיה הישנה (100 μL) והחלפתם באותו נפח של מדיום תרבית נוירונים מוטוריים טריים. ודאו שתהליכים עצביים נראים לעין ב-1 DIV ונעשים עבים וארוכים יותר ב-14 DIV (איור 3). גופי תאי עצב מוגדלים ונוטים להצטבר בתרביות ארוכות טווח, במיוחד עבור SMN (איור 3).
הערה: בצע את כל שינויי המדיום והתמיסה על-ידי השארת מחצית מנפח המדיום המקורי כדי למנוע ניתוק תאים בתרבית. זה כולל שלבי קיבוע ואימונוציטוכימיה (ICC). אם כל המדיה מוסרת, לא משנה באיזו עדינות, רוב התאים יתנתקו ויישטפו.
