טיפול בתרביות תאי גזע עצביים במתקן לייצור תאים

תקציר

מקור: Stover, A. E., et al,. גידול תאי גזע פלוריפוטנטיים ועצביים אנושיים במערכת תרבית תאים סגורה למחקר בסיסי ופרה-קליני. J. Vis. Exp. (2016).

הסרטון מתאר את הנוהל לשמירה על סביבה מבוקרת בתחנת עבודה של תרבית תאים לגידול ותחזוקה של תאי גזע עצביים. נהלים אלה כרוכים בקביעת תנאי החדר, פרוטוקולי ניקוי והכנת מדיה, ובכך שמירה על סטריליות ושחזור מרביים והחלפת השיטות המסורתיות.

פרוטוקול

1. הגדרה ראשונית

1. קביעת ריכוזי גז וטמפרטורה
   1. באמצעות התוכנה, לחץ על הכרטיסייה "אורח" בפינה השמאלית העליונה של הממשק הגרפי. היכנס למערכת באמצעות שם משתמש וסיסמה ייעודיים. ודא שלכל משתמש יש את שם המשתמש והסיסמה שלו.
   2. לחצו על מודול כדי להתאים (איור 1). בתוך החלון החדש המציג את ההגדרות הנוכחיות, לחץ על ערך נקודת ההגדרה הקיים של O₂ מתחת ל"נקודת הגדרה" והזן את רמת הריכוז הנדרשת של מודול זה O₂. הזן 5% O₂ אם תאי גזע פלוריפוטנטיים יגדלו או יעברו מניפולציה במודול זה ו- 9% O₂ אם תאי גזע עצביים יגדלו או יעברו מניפולציה. לחץ על סימן הביקורת הירוק כדי לאשר את נקודת ההגדרה.
      הערה: שני מודולים אינם ניתנים לכוונון גז: מכסה המנוע הלמינרי ותא המיקרוסקופ. ריכוזי הגזים במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית הם אטמוספריים, בעוד אלה שבתא התהליך שומרים באופן פסיבי על אלה שבתא המיקרוסקופ.
   3. חזור על שלב זה עבור CO₂. הזן נקודה מוגדרת של 5% CO₂ עבור כל המודולים, למעט תאי החיץ, המתכווננים רק עבור O₂.
   4. נטר את ריכוזי הגז הנוכחיים המסומנים כ"ערכי תהליך" כדי לוודא שהם מגיעים לנקודות הקבועות החדשות.
   5. התאם את נקודות הגדרת הגז של כל המודולים לערכים המתאימים. התאימו את רמות CO₂ ו-O₂ של תאים שיהיו חשופים זה לזה. לדוגמה, התאימו את תא התהליך ל-5% O₂ לפני פתיחת אינקובטור שמגדל תאים ב-5% O₂. כמו כן, שנה ל- 5% O₂ בכל תא חיץ המשמש להוספת פריטים לתא התהליך במהלך תקופה זו.
   6. הגדר את הטמפרטורה של תא התהליך ל- 37 °C באמצעות אותו מסך לכוונון גז. כמו כן, טמפרטורת הרצפה של תא התהליך צריכה להיות מוגדרת ל 37 °C (77 °F).
   7. לחץ על מודול הדגירה מתחת לכל אינקובטור. התאם את טמפרטורת הבנקים ל 37 °C (77 °F).
2. הפעלת תאי חיץ
   1. אסוף את כל החומרים הדרושים למשימה הנתונה (הזנה, פיצול, צביעה וכו ') בהתחלה כדי למנוע עיכוב בזרימת העבודה. רססו בנדיבות את כל החומרים באתנול 70% והניחו להם להתייבש במכסה המנוע הלמינרי. אין לרסס צלוחיות או צלחות של תאים - נגבו אותן בעדינות בספוג גזה סטרילי רווי באתנול 70%.
   2. ודא שהדלתות החיצוניות והפנימיות של תא החיץ סגורות היטב. לאחר מכן, פתחו את הדלת החיצונית והניחו את הפריטים בפנים.
   3. סגור את הדלת החיצונית. בחר את מודול המאגר בתוך התוכנה ולחץ על הכרטיסייה גורם דילול. הזן אחד בתיבה יומן רישום. לחץ על start.
      הערה: "גורם דילול" פירושו שהאטמוספירה של מודול החיץ תפונה ותוחלף פעם אחת בגז נקי מסונן HEPA.
   4. ברגע שהממשק הגרפי מפסיק להבהב "גורם דילול", פתחו את הדלת הפנימית של תא החיץ והכניסו את החומרים לתוך תא התהליך.
      אזהרה: אל תאפשרו לדלתות הפנימית והחיצונית להיפתח בו זמנית, ואל תפתחו את הדלת הפנימית אם תא החיץ לא עבר גורם דילול.
   5. ראשית, הוציאו פריטים מתא התהליך וודאו שתא החיץ עבר גורם דילול. לאחר מכן, פתחו את הדלת הפנימית, הניחו את הפריטים שיש להסיר בפנים וסגרו את הדלת הפנימית. לאחר מכן, פתח את הדלת החיצונית והסר את הפריטים.
      הערה: אין להפעיל מקדם דילול לפני פתיחת הדלת החיצונית.

2. היכרות והזנת תאים

1. הקמת חממה
   1. מניחים 3 צלחות פטרי במחבת המים שבבסיס כל אינקובטור. ממלאים את הכלים האלה במים סטריליים, לא ממלאים ישירות את המחבת. שמרו על מפלס המים בכלים אלה, שכן הם קריטיים לשמירה על נקודת הלחות היחסית (RH) של האינקובטורים.
   2. בתוך הממשק הגרפי, לחץ על החממה. תחת נקודת ההגדרה, לחץ על ערך הלחות היחסית (RH) הקיים והזן 85%. לחץ על סימן הביקורת הירוק כדי לקבל ערך זה.
2. הכנת מתקן ייצור תאים לתאים
   1. אם עדיין לא נעשה זאת, התאימו את תאי החיץ, תא התהליך והאינקובטור לנקודות הגדרת הגז הדרושות לסוג התא המוכנס.
   2. נקו את פני השטח של תא התהליך עם גזה סטרילית וחומר חיטוי לא דליק. אין להשתמש בכל חומר חיטוי על בסיס חומצה פראצטית; במערכת סגורה, האדים החזקים והמתמשכים רעילים לתאי יונקים. במקום זאת, השתמש במוצרים מבוססי בנזלקוניום כלוריד.
   3. יש להמשיך לחטא. נקו את הכפפות והמשטחים שנוגעים בהם לעתים קרובות, כגון ידיות דלתות. השתמשו בחומר החיטוי ביסודיות אך במשורה, שכן עודף נוזלים בתא התהליך יתרום ללחות, עיבוי וצמיחה מיקרוביאלית אפשרית.
   4. נקו את פני השטח של מכסה המנוע ותא החיץ הלמינרי עם 70% אתנול ואפשרו לו להתייבש. מניחים את הבקבוק או צלחת התאים (במקרה שלנו, PSCs (תאי גזע פלוריפוטנטים) או NSCs (תאי גזע עצביים)) במכסה המנוע ונגבו לזמן קצר את פני השטח החיצוניים שלו עם ספוג גזה סטרילי רווי אתנול.
   5. שים את הבקבוק או הצלחת בתא החיץ והפעל גורם דילול (שלב 1.2.3).
   6. עם השלמת גורם הדילול, מיד להעביר את הבקבוק או הצלחת לאינקובטור המתאים. כאשר האינקובטורים נמצאים בחלק האחורי של תא התהליך, משוך מדף החוצה לתוך תא התהליך למיקום התא. הימנעו מפתיחת דלתות האינקובטור שלא לצורך או לפרקי זמן ממושכים, שכן האוויר בתא התהליך יבש מאוד בהשוואה לזה של האינקובטורים ויגרום לאובדן לחות משמעותי באינקובטור.
3. הזנת תרביות תאים
   1. אספו רכיבים בינוניים, כגון פיפטות סרולוגיות, פיפטור אלקטרוני, גזה וחומר חיטוי. כמו כן, לאסוף מיכל פסולת עבור מדיום תרבית התא משומש, אבל לא למלא אותו עם אקונומיקה. הכנס את החומרים לתא התהליך דרך תא חיץ כמתואר בסעיף 1.2. סדרו את החומרים כך שיאפשרו מרחב עבודה אופטימלי. הימנע ממיקום פריטים שאינם בשימוש במרכז תא התהליך.
   2. השאר את מיכל המדיה מעט לא מכוסה כדי לאפשר למדיום להתאזן עם רמות CO₂ ו- O₂ הקיימות במערכת. כמה יצרני PSC בינוניים מציינים לא לחמם מדיה ב 37 מעלות צלזיוס; אם כן, השתמש בתא חיץ כדי לאזן את המדיום. אפשר למדיום להתאזן למשך 20 דקות.
   3. הסר את המדיום הישן מבארות באמצעות פיפטה סטריאולוגית מתאימה ופיפטור אלקטרוני. עבור PSCs, יש להסיר את כל התווך הישן מלבד כמות קטנה שנותרה כדי למנוע התייבשות במהלך תהליך ההאכלה. עבור NSCs, להסיר חצי של המדיום הישן. הכניסו את הפסולת למיכל האשפה.
   4. החזירו את הפיפטה המשומשת לעטיפתה המקורית והעבירו אותה לצד תא התהליך או לתא חיץ המיועד לפינוי פסולת. בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילית טרייה, מוסיפים מדיום טרי לצלחות תרבית תאים ומחזירים את הצלחות לאינקובטור הייעודי שלהן.
   5. בסיום ההאכלה מרססים גזה בחומר חיטוי ומנקים היטב את הרצפה ואת ידיות הדלתות של תא התהליך. אם מגדלים מספר קווי תאים במערכת, יש לעקר בין הזנת כל קו תא. זה עוזר למזער את הסיכון של זיהום צולב.
   6. הסר פסולת או פריטים מיותרים אחרים דרך אחד מתאי החיץ בסיום.

3. פיצול תרביות תאים

1. מעבר אנזימטי של PSCs או NSCs
   1. אסוף את כל הפריטים הדרושים למעבר. זה כולל מדיה, אנזים או חיץ דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים (האחרון מיועד לתאי גזע עצביים בלבד), DPBS (מלח חוצץ פוספט של דולבקו), צלחות או צלוחיות, מטריצה חוץ-תאית (ECM), צינורות חרוטיים, ופיפטות סרולוגיות. הכנס אותם למערכת באמצעות תא חיץ.
   2. מעיל צלחות טריות או צלוחיות עם ECM, כפי שתואר קודם 9,10. ECMs מסוימים - כגון אלה הנגזרים משורות תאי סרקומה של עכבר - הם נוזליים רק בין 4 ל -15 מעלות צלזיוס, לכן השתמש בבלוק קר מעוקר או בחבילת קרח ג'ל כדי לשמור על ECM קר בזמן העבודה בתא התהליך המחומם.
   3. יש להוציא את המדיום המשומש מהתרבית ולהשליך אותו למיכל הפסולת.
   4. יש לשטוף היטב או את משטח הבקבוק באמצעות 1 מ"ל של DPBS/ היטב ולהשליך את DPBS.
   5. מוסיפים 1 - 2 מ"ל של אנזים חם לכל באר. רק תרביות צפופות מאוד דורשות 2 מ"ל.
   6. העבירו מיד את צלחת התרבית או הבקבוק לתא המיקרוסקופ והתבוננו בתרבית. שימו לב לסימנים של תאים בודדים שמתחילים להשתחרר מהמנה. אל תחכו עד שהתאים יצופו להשעיה לפני שתמשיכו לשלב הבא.
   7. החזר את התאים לתא התהליך הראשי. באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, הוסף 4 מ"ל של DPBS עבור כל 1 מ"ל של אנזים, ולאחר מכן צינור בכוח למעלה ולמטה כדי לעקור את התאים מפני השטח של הבאר. אם מעבירים בארות מרובות בתוך צלחת מרובת קירות, הוסף את ה- DPBS לכל באר לפני הוצאת התאים מהבארות הבודדות.
   8. מעבירים את האנזים ואת תרחיף תאי PBS לצינור חרוטי בגודל מתאים.
   9. אם אין צנטריפוגה זמינה במתקן ייצור התא, אטמו היטב את הצינור החרוט, הניחו אותו בתא חיץ ואטמו את הדלת סגורה.
   10. הסר את הצינור החרוטי מתא החיץ מצד הזרימה הלמינרית וסובב את התאים במהירות של 100 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
   11. רססו את הצינור החרוטי באתנול 70% והכניסו אותו לתא התהליך באמצעות תא חיץ וגורם דילול.
   12. Pipet off supernatant ו resuspend את התאים ב 2 מ"ל של PSC או מדיום NSC. אם PSCs עוברים, יש לכלול מעכב ROCK(Rho-associated protein kinase) בתווך בריכוז של 10 מיקרומטר.
   13. ספור את התאים באמצעות hemocytometer ולקבוע את הבארות או לוחות הדרושים. צלחת PSCs ב 5 x 10⁴ - 1 x 10⁵ תאים / ס"מ². פיצול NSCs ביחס של 1:2.
       הערה: לעתים קרובות NSCs מתגבשים ומתנגדים לספירה מדויקת בהמוציטומטר.
   14. אם נדרש שימור בהקפאה של התאים, ודא שכל האספקה ואמצעי ההקפאה מוכנים וממוקמים בתוך תא התהליך. DMSO (Dimethylsulfoxide) הוא רעיל מאוד לתאים ב 37 מעלות צלזיוס, אז זה עובד במהירות. שמור את מיכל ההקפאה עם מעטפת איזופרופנול ב- RT במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. לאחר מילוי ואטימת בקבוקוני ההקפאה, הוציאו אותם מיד מתא התהליך על ידי העברתם דרך תא חיץ.
2. העברה ידנית של PSCs
   1. לאשר כי התרבות צריכה להיות עבר, כפי שתואר לעיל. אם כן, הכינו צלחות או צלוחיות טריות מצופות במטריצה חוץ-תאית. לאחר מכן, שנה את המדיום לחלוטין.
   2. נקו את תא המיקרוסקופ עם גזה סטרילית רטובה בכמות חסכנית של חומר חיטוי לא דליק – יותר מדי יגרום לערפול עודף. נקו רק את הכפפות, שטח הרצפה והבמה. הביאו מספר קצוות פיפט עטופים בנפרד של 200 μl או 1,000 μl לתוך התא.
   3. הכניסו את צלחת ה-PSC לתא המיקרוסקופ, הסירו את המכסה והניחו אותה עם הפנים כלפי מטה על הרצפה שזה עתה נוקתה. השארת המכסה כלפי מעלה חושפת את החלק התחתון ישירות לזרמי אוויר ולזיהום פוטנציאלי.
   4. שחררו קצה צינור, והשתמשו במיקרוסקופ כדי להמחיש את התרבות, בחרו מושבות עם מורפולוגיה טובה באמצעות קצה הפיפט.
      הערה: קצה הפיפט עשוי להיות מחובר לפיפט אם המשתמש הבודד מוצא זאת נוח יותר.
   5. החלף את מכסה הצלחת והזז את הצלחת חזרה לתא התהליך.
   6. מסירים את עודפי ה-ECM מהצלחת החדשה ומעבירים את המדיה מהצלחת הישנה (המכילה את חתיכות המושבה בתרחיף) לצלחת החדשה. אם הצלחת הישנה עדיין מכילה מושבות שאינן מוכנות לקטיף, האכילו גם אותן.

תוצאות

איור 1. ממשק גרפי למתקן ייצור התא. (A) הייצוג הגרפי של CPF הוא מסך ברירת המחדל ותואם לשרטוט CAD המוצג באיור 3. לחיצת עכבר מעל Buffer Module 1 פותחת את מסך הבקרה שלו (B), שבו ערכי O₂ מוגדרים כך שיתאימו לתא העיבוד. באופן דומה, לחיצה על תא התהליך או אינקובטור 1 מעלה את מסכי הבקרה המתאימים שלהם (C ו- D, בהתאמה), שבהם ניתן לשנו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מערכת Xvivo	ביוספריקס	בהתאמה אישית
תוכנת Xvivo	ביוספריקס	גרסה I.O.2.1.2.1
סעפת O2	אמיקו	P-M2H-C3-S-U-OXY
סעפת CO2	אמיקו	M2H-C3-D-U-CO2
סעפת N2	Western Innovator	CTM75-7-2-2-BM
גז O2
גז CO2
גז N2
צלחת פטרי
מים
גזה סטרילית
70% אתנול	ב.ד.ה	BDH1164-4LP
חומר חיטוי על בסיס בנזלקוניום כלוריד
פוספט של דולבקו חוצץ מלוחים
מאגר הדיסוציאציה התאית המבוסס על האנק	לייף טכנולוגיות	13150-016
2 מ"ל פיפט סרולוגי	VWR	89130-894
5 מ"ל פיפט סרולוגי	אולימפוס פלסטיק	12-102
10 מ"ל פיפט סרולוגי	אולימפוס פלסטיק	12-104
25 מ"ל צינור סרולוגי	אולימפוס פלסטיק	12-106
50 מ"ל פיפט סרולוגי	אולימפוס פלסטיק	12-107
צלחת 6 בארות	קורנינג	353046
טיפים לפיפט 20uL	אפנדורף	22491130
200uL טיפים פיפט	אפנדורף	22491148
1000 טיפים פיפט	אפנדורף	22491156
מיקרוסקופ עם מצלמת DP21 ופלואורסצנטיות	תאגיד אולימפוס	CKX41
נתרן חוצץ פוספט	היקלון	9236
דימתיל סולפוקסיד	פרוטיד	עמ' 1130
כפפות

.