$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
קו תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hiPSC), HPS1006, סופק על ידי RIKEN BRC באמצעות פרויקט המשאבים הביולוגיים הלאומי של MEXT / AMED, יפן.
1. השראת התמיינות hiPSC לתאי אב אנדותל (EPC)
- לוחות וריאגנטים מצופים מטריצה חוץ-תאית (ECM)
- הכינו צלחות 12 בארות מצופות ממברנת מרתף על ידי הזרקת 2.5 מ"ג של ג'ל מטריקס לצינורות צנטריפוגות של 50 מ"ל לאחסון בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים. הוסיפו 30 מ"ל של תערובת בינונית/תזונתית F-12 (DMEM/F12) של Dulbecco קרה, שנשמרה במקרר (4°C), לתוך הצינור. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג עד שהג'ל מפשיר ולאחר מכן מוסיפים 500 μL של התמיסה לכל באר של צלחת 12 בארות. מניחים את הצלחת באינקובטור (37°C, 5% CO2) למשך 1 שעות < לפחות>
הערה: ג'ל מטריצת קרום המרתף רגיש לטמפרטורה ויש לטפל בו בהתאם להוראות היצרן לציפוי פלטות. הריכוז של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים יכול להשתנות בין אצוות. כדי להבטיח דיוק, יש להתייחס לריכוז המדויק בגיליון תעודת האיכות של האצווה הספציפית, באמצעות מספר הלוט. לדוגמה, אם הריכוז המדויק הוא 10.0 מ"ג / מ"ל, להשתמש 250 μL של ג'ל עבור סך של 2.5 מ"ג.
- הכינו תמיסת מלאי מעכבי רו-קינאז (ROCK) על ידי המסת מעכב ROCK במים סטריליים לריכוז של 10 מילימטר (טבלה 1). Aliquot את תמיסת המלאי בנפחים של 100-200 μL ואחסנו ב -20 °C כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה.
- הכינו תמיסת מלאי של 100 מ"ג/מ"ל של חומצה L-אסקורבית על-ידי המסת 5 גרם חומצה L-אסקורבית ב-50 מ"ל מים סטריליים ואחסנו בטמפרטורה של -20°C (טבלה 1). הוסף 6.25 מ"ל גלוטמין ו-305 מיקרוליטר של תמיסת ציר חומצה L-אסקורבית ל-500 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם כדי ליצור מדיום LaSR (טבלה 1). יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
- הכן תמיסה CHIR99021 על-ידי המסת CHIR99021 בדימתיל סולפוקסיד לא מדולל (DMSO) לריכוז סופי של 10 מילימטר (טבלה 1). Aliquot את התמיסה לתוך נפחים 100-200 μL כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה ולאחסן ב -20 ° C עד 1 שנה. אחסן aliquots עבודה של פתרון המניות ב 4 °C למשך עד חודש אחד.
- הכינו DMEM/F12-10 בינוני על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום בקר עוברי מומת בחום ל-450 מ"ל DMEM/F12. אחסנו את המדיום בטמפרטורה של 2-8°C למשך עד חודש אחד (טבלה 1).
- הכינו את חיץ הזרימה-1 על-ידי הוספת 33.3 מ"ל של אלבומין בסרום בקר (BSA) של 7.5% ל-467 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) של Dulbecco (טבלה 1). יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8°C למשך עד 6 חודשים.
- זריעה של hiPSCs ייחודיים והרחבה להתמיינות EPC (יום -3 עד יום -1)
- התחל התמיינות כאשר מושבות hiPSC בלוח 6 בארות אינן מראות התמיינות ספונטנית ויש להן את הצפיפות המתאימה למעבר, בדרך כלל סביב 80% מפגש (2.5-3.5 x 106 תאים). עקוב בזהירות אחר תאים ממוינים באופן ספונטני תחת המיקרוסקופ כדי לוודא אם נדרשים מעברים מרובים כדי לחסל תאים שאינם ממוינים. עיין בהערה המובאת להלן, שלב 1.4.15 לקבלת מידע אודות תרבית תאים, מדיום ומטריצה, חוץ-תאית.
- לשאוף את המדיום ולהוסיף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה לבארות לדגור במשך 5-7 דקות ב 37 ° C. לנתק ו singularize התאים על ידי pipeting פתרון מגיב דיסוציאציה בעדינות על פני השטח של הבארות פעמיים או שלוש.
- מעבירים את התאים המנותקים לצינור של 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל של מדיום תחזוקה hiPSC ומשהה מחדש את התאים ביסודיות. שמור aliquot 10 μL לספירת תאים.
- גלול את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 x גרם ב 20-25 ° C. לספור את התאים ולחשב את הנפח הנדרש כדי להשיג צפיפות מתאימה של hiPSCs (75-400 x 103 לכל באר) בממברנה מרתף מצופה מטריצה 12 באר צלחת (שלב 1.1.1).
- שאפו את תמיסת הציפוי מהבארות והוסיפו 1 מ"ל של תווך hiPSC המכיל מעכב ROCK של 10 מיקרומטר לכל באר (דילול 1:1,000). לאחר הצנטריפוגה, שואפים את הסופרנאטנט ומנתקים את הגלולה ב 1 מ"ל של תווך hiPSC.
- הוסף את הנפח הנדרש של hiPSC, שנקבע בשלב 1.2.4, לכל באר של צלחת 12 בארות. שתיים עד ארבע צלחות בנות 12 בארות עשויות להספיק כדי להבדיל בין שיבוט hiPSC. עיין בשלב 1.2.4 כדי לקבוע את מספר הלוחות הדרושים לזריעת תאים.
- מניחים את הצלחת באינקובטור (37°C, 5% CO2). פיזור אחיד של התאים על ידי החלקת הצלחת בעדינות קדימה ואחורה ולאחר מכן מצד לצד באינקובטור.
- למחרת (כלומר, יום -2), החליפו את המדיום ב-2 מ"ל של מדיום תחזוקה hiPSC חסר מעכב ROCK. למחרת (יום -1), להחליף את המדיום עם 2 מ"ל של אמצעי תחזוקה hiPSC טרי.
- השראת EPC עם מעכב גליקוגן סינתאז קינאז 3 (GSK-3) CHIR99021 (יום 0 עד יום 5)
- ביום 0, החלף את אמצעי התחזוקה hiPSC בכל באר ב- 2 מ"ל של תווך LaSR המכיל 8 מיקרומטר CHIR99021.
- ביום הראשון, שאפו את המדיום והוסיפו 2 מ"ל של מדיום LaSR טרי המכיל 8 מיקרומטר CHIR99021.
- בימים 2, 3 ו-4, החלף את המדיום ב-2 מ"ל של מדיום LaSR טרי חסר CHIR99021.
- מיון תאים מופעלים מגנטית (MACS) לטיהור CD31+ EPC (יום 5)
- ביום 5, שואפים את המדיום ולאחר מכן מוסיפים 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה לכל באר, לפני הדגירה במשך 6-8 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- נתקו וסינגולריזציה של התאים באמצעות מיקרופיפטה ועברו דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי לסנן את התרחיף לתוך צינור של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיום DMEM/F12-10. סנן את תרחיף התא שנאסף מיותר משני לוחות 12 בארות לשני צינורות 50 מ"ל לפחות.
- עצור את תגובת העיכול על ידי הוספת מדיום DMEM/F12-10 (עד 50 מ"ל). פיפטה ביסודיות ולשמור 10 μL לספירת תאים. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 x גרם ב 20-25 ° C.
- לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסף 10 מ"ל של מדיום DMEM/F12-10 והעבר את תרחיף התא לצינורות טריים של 15 מ"ל. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 x גרם ב 20-25 ° C.
- לשאוף את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש לתוך חיץ זרימה -1 בצפיפות של 1.0 x 107 תאים לכל 100 μL של חיץ.
- הוסף מגיב חוסם קולטן Fc (FcR) ביחס של 1:100 ודגור במשך 5 דקות לפני הוספת נוגדן CD31 מדולל 1:200 עם תווית פלואורסצאין (FITC). לדגור את המתלה במשך 30 דקות בחושך ב 20-25 מעלות צלזיוס.
- הוסף 10 מ"ל של חיץ זרימה-1, ושמור 10 μL של המתלה לניתוח ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את החלק של תאי CD31+ (איור 1).
- גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 20-25 ° C. לאחר מכן, הסר את supernatant ו resuspend לצפיפות של 1.0 x 107 תאים לכל 100 μL של תמיסת חיץ זרימה -1. הוסף את קוקטייל הבחירה FITC (5 μL לכל 100 μL של תרחיף התא). מערבבים היטב על ידי פיפטינג ודגרים בחושך במשך 15 דקות ב 20-25 מעלות צלזיוס.
- הוסף 5 μL של ננו-חלקיקים מגנטיים לכל 100 μL של תרחיף התא, פיפטה היטב, ודגור בחושך במשך 10 דקות ב 20-25 ° C.
- העבר את מתלה התא לצינור ציטומטריית זרימה של 5 מ"ל והוסף חיץ זרימה-1 כדי להשיג נפח כולל של 2.5 מ"ל. מניחים את ציטומטריית הזרימה במגנט למשך 5 דקות.
- בתנועה רציפה, הפוך את המגנט ונטרל את תרחיף התא המכיל תאים שלא סומנו בנוגדן FITC-CD31. שמור על המגנט והצינור במצב הפוך למשך 2-3 שניות ולאחר מכן הסר את שאריות הנוזלים. שאפו את כל הטיפות על קצה הצינור לפני שתחזירו את הצינור למצב זקוף.
- הרימו את ציטומטריית הזרימה מהמגנט והוסיפו 2.5 מ"ל של חיץ זרימה -1 כדי לשטוף את תאי CD31+ הנותרים. השהה מחדש את התאים על ידי פיטום עדין של התאים למעלה ולמטה פעמיים או שלוש. הכניסו את צינור הזרימה למגנט למשך 5 דקות.
- חזור על שלבים 1.4.11-1.4.12 שלוש פעמים ולאחר מכן על שלב 1.4.11 פעם נוספת עבור סך כולל של ארבע כביסות.
- הסר את צינור הזרימה מהמגנט והוסף את הכמות המצוינת של מדיום מתאים (למשל, מדיום ללא סרום אנדותל אנושי [hECSR] לתרבית EC מורחבת או מדיום הקפאה להקפאה) לצינור כדי להשהות מחדש את תאי CD31+ מטוהרים. שמור שני aliquots 10 μL של התרחיף, אחד עבור ספירת תאים והשני לבצע ניתוח ציטומטריה זרימה כדי להעריך את הטוהר של תאי CD31+ בדגימות פוסט-MACS (איור 1). אם ציטומטר זרימה אינו זמין באופן מיידי, לאחסן את aliquot ב 4 °C עד לניתוח.
- הקפיא את CD31+ EPCs בשלב זה.
הערה: ניתן להשתמש בצלחות 12 בארות מצופות ויטרונקטין ובאמצעי תחזוקת hiPSC יציב יותר (mTeSR plus) במקום לוחות ממברנות מרתף מצופות מטריצה ואמצעי תחזוקה hiPSC (mTeSR1). להכנת לוחות 12 בארות מצופות ויטרונקטין, מדללים ויטרונקטין עם חיץ דילול לריכוז סופי של 10 מק"ג/מ"ל ולאחר מכן מעבירים 500 מיקרוליטר של התמיסה המדוללת לכל באר של 12 הבארות. השאירו את הצלחות ב 20-25 מעלות צלזיוס לפחות 1 שעות. צפיפות הזריעה של hiPSCs סינגולריים דומה לזו המשמשת ללוחות מצופים מטריצת קרום מרתף. שינוי מדיום התרבית או הרכב המטריקס עשוי להשפיע על התפשטות והתמיינות ספונטנית של hiPSCs, אשר בדרך כלל דורשים 1-2 שבועות כדי להסתגל לתנאי תרבות חדשים. אם אמצעי תחזוקת hiPSC יציב יותר משמש לתחזוקת hiPSC, ניתן להשתמש בתווך זה לבידול EPC במקום במדיום תחזוקת hiPSC. במקרה זה, יש לשנות את מדיום תחזוקת hiPSC היציב יותר ביום -2 כדי להסיר מעכב ROCK, וניתן לדלג על ההחלפה ביום -1.