$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. מלאי הכנה בינונית ושחזור תאי גזע
- הכן תרבית מלאי בינוני (DFHGPS) על ידי שילוב ריאגנטים בשלבים 1.1.1.-1.1.5.
- הוסף 210 מ"ל של Dulbecco Modified Eagle Medium עם גלוקוז גבוה ו- L-גלוטמין (D). אחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C.
- הוסף 70 מ"ל של תערובת תזונתית F12 של בשר חזיר עם תוסף L-גלוטמין (F). אחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C.
- הוסף 4.2 מ"ל של 15 mM HEPES Buffer (H) ואחסן אותו בטמפרטורת החדר.
- הוסף 4.2 מ"ל של 10% D-גלוקוז תמיסת (G) ואחסן אותו בטמפרטורת החדר.
- הוסף 2.88 מ"ל של תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין (PS). Aliquot את תמיסת המלאי לתוך 3 מ"ל aliquots ולאחסן את aliquots ב -20 °C עד הצורך.
הערה: הריכוז הסופי של פניצילין בתווך יהיה 100 יחידות / מ"ל, וריכוז סטרפטומיצין יהיה 100 מיקרוגרם / מ"ל. תווך זה ייקרא DFHGPS למשך שארית הפרוטוקול ויש לאחסן אותו ב -4 ° C לשימוש תוך 1-2 שבועות. במידת הצורך, ניתן להגדיל את DFHGPS באופן פרופורציונלי.
- יום לפני שהתאים מתאוששים, יש לצפות בקבוק T75 ב-5 מ"ל של מדיום מותנה שהתקבל מתרביות קודמות של קו תאי hNSC ולהשאיר אותו באינקובטור של 37°C עם 8.5% פחמן דו-חמצני (CO2) למשך הלילה.
הערה: אם כרגע מטפחים hNSCs, שמור את המדיום שבו התאים גדלו במהלך שינוי בינוני. זהו מדיום מותנה כפי שהוא "מותנה" על ידי התאים. ניתן לשמור את המדיום הממוזג בצינור מכסה בורג ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך כ-7 ימים. פנה למחבר המתאים כדי לקבל hNSCs. מדיום מותנה הוא מועדף אך לא הכרחי לחלוטין, במיוחד כאשר מתחילים לראשונה את התרבות של hNSCs.
- ביום ההתאוששות, יש לחמם 20 מ"ל של DFHGPS בצינור מכסה בורג של 50 מ"ל באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות ולשמור אותו באמבט המים עד שהוא מוכן לשימוש.
- בצינור נפרד עם מכסה בורג של 15 מ"ל, יש לחמם 10 מ"ל של DFHGPS באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות לפחות ולשמור אותו באמבט המים עד שיהיה מוכן לשימוש בשלב 1.13.
- אחזר מכל קרח ואת כל הרכיבים הבינוניים (טבלה 1). הפשירו את כל המרכיבים הבינוניים על הקרח והשאירו אותם על הקרח תוך כדי הכנה לשינוי הבינוני.
- קבל 5 מ"ל של מלאי בינוני מותנה (מאוחסן ב 4 ° C) ולשמור אותו באמבט מים 37 ° C עד מוכן לשימוש בשלב 1.14. ראה הערה לאחר שלב 1.2 אם אין תרבית תאי גזע עצבית אנושית מותנית, בינונית או נוכחית.
- אחזר את צינור מכסה הבורג בנפח 50 מ"ל משלב 1.3 והנח אותו בארון הבטיחות הביולוגית (BSC). העבר 10 מ"ל של DFHGPS לצינור מכסה בורג חדש של 15 מ"ל, ולאחר מכן הנח את צינור 50 מ"ל המכיל את 10 מ"ל הנותרים של מדיום DFHGPS בחזרה באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס.
- השג בקבוקון קריו-של hNSCs המאוחסנים בחנקן נוזלי. ראה הערה לאחר שלב 1.2 אם אין כיום תרבית תאי גזע עצביים עובריים אנושיים.
הערה: תאי גזע עצביים אנושיים נגזרו במקור ממוחות עובריים אנושיים שהושלכו12 ונשמרו בתרבית ללא שינויים גנטיים10. 5 × 106 תאים יש להפשיר ולצפות על בקבוק T75. כל בקבוקון קריו-בקבוקון צריך להכיל 5 × 106 תאים; לכן, בקבוקון אחד לכל בקבוק יש צורך.
- הפשירו בקבוקון של תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס על ידי היפוך הבקבוקון כל 10 שניות למשך כדקה אחת או עד שהקרח נמס ותכולת הבקבוקון נוזלית לחלוטין. אין לטבול את כל הבקבוקון מתחת למים כדי למנוע זיהום פוטנציאלי.
- ב- BSC, השתמש במיקרו-פיפטה P1000 כדי לשאוף את תמיסת התאים המופשרת והוסף אותה טיפה לצינור 15 מ"ל משלב 1.7, המכיל 10 מ"ל DFHGPS. כדי להוסיף את תמיסת התאים המופשרת מבחינת טיפה, לחץ באיטיות על הבוכנה, כך שרק טיפה או שתיים משתחררות בבת אחת. בינתיים, מערבלים את הצינור של 15 מ"ל כדי לאפשר תערובת מהירה.
- צנטריפוגה את מתלה התא ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט, והקפידו לשמור על כדורית התא.
- במהלך שלב 1.11, אחזר את הצינור של 50 מ"ל המכיל את 10 מ"ל הנותרים משלב 1.7. לאחר הצנטריפוגה, להשהות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל DFHGPS ולצנטריפוגה שוב ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- במהלך הסחרור הסופי, הכן את מדיום הצמיחה החדש על-ידי ביצוע טבלה 1 כדי להוסיף גורמי גדילה ל-10 מ"ל של מדיום DFHGPS משלב 1.4 (טבלה 1) ב-BSC. השאירו את המדיום החדש המכיל גורמי גדילה ב-BSC עד שיהיה מוכן לשימוש.
- שלפו את בקבוק T75 משלב 1.2 והשליכו את התווך המותנה המצפה את הבקבוק לפי שאיפה. לאחר מכן, הוסף את 5 מ"ל של מדיה מותנית משלב 1.6. לבקבוק באמצעות פיפטה סרולוגית. היזהר לא לגרד את החלק התחתון של הצלוחית.
- שלפו את צינור התאים מהצנטריפוגה והשליכו את הסופרנאטנט על ידי שאיפתו, תוך השארת כדורית התא שלמה.
- השהה מחדש את גלולת התא ב -10 מ"ל של מדיה חדשה משלב 1.13 באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל ופיפטציה למעלה ולמטה מספר פעמים. הוסף את המתלה לבקבוק T75 המצופה משלב 1.14. השתמש 5 מ"ל הנותרים כדי לשטוף את הצינור שהכיל את גלולת התא, ולאחר מכן להוסיף אלה 5 מ"ל לבקבוק גם כן.
- נענעו את בקבוק T75 קדימה ואחורה 3 פעמים כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן שווה על פני הצלוחית. ודא שהמכסה של הבקבוק רופף כדי לאפשר זרימת אוויר. תחת מיקרוסקופ אור, התבוננו בתאים, רשמו הערות וצלמו תמונות במידת האפשר.
הערה: התאים צריכים להיראות שקופים וכדוריים. רשום לעצמך אם ישנם תאים שנראים כהים, אטומים או בעלי גבולות לא סימטריים, מכיוון שהדבר יכול להצביע על מוות תאי. כמו כן, שימו לב לכל זיהום פטרייתי או חיידקי, כגון המדיה הופכת בצבע צהוב.
- מניחים את בקבוק התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 8.5% CO2.
הערה: השתמשו ב-8.5% במקום ב-5.0%CO2 כדי לשמור על רמת החומציות של מדיית תרבית נטולת סרום זו בטווח של 7.1-7.4.
2. hNSC שינוי בינוני
הערה: שנה בינוני כל 3-4 ימים.
- הפעל את BSC ונקה היטב עם 70% אתנול. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ אור.
הערה: רשום הערות על מראה התאים וגדלי הכדורים. שלושה ימים לאחר ההחלמה או המעבר, תאים יתקבצו יחד ויתחילו ליצור נוירוספרות לא דבקות.
זהירות: אם התאים נצמדים לתחתית הצלוחית, יהיה צורך להשליך את התרבית מכיוון שהיצמדות התאים תגביר התמיינות מוקדמת, ותאים לא יוכלו לשמור על מצב גזע. אם יש יותר מדי תאים בצלוחית, התאים עשויים ליצור כדורים גדולים (בקוטר של יותר מ -2 מ"מ), ובמקרה זה, תאים במרכז הכדור יתחילו להתמיין בשל חוסר גישה לגורמי גדילה בתווך. אם נצפים כדורים בקוטר של יותר מ -1 מ"מ, ניתן לעבור תאים (שלבים 3.1-3.22).
- בצע את שלבים 1.4 ו- 1.5, והכן 10 מ"ל של מדיום טרי (ראה שלב 1.13).
- הטו את הבקבוק הצידה, ואפשרו לכדורים לשקוע לתחתית הצלוחית.
- הסר 5 מ"ל של מדיה מותנית מהחלק העליון של המדיום המאוחד באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל, תוך הקפדה לא לשאוף נוירוספרות כלשהן. מניחים את 5 מ"ל של מדיה ממוזגת לתוך צינור נקי 15 מ"ל.
- הסר 5 מ"ל נוספים של מדיה מותנית מן הצלוחית, שוב בזהירות הימנעות הכדורים, ומניחים את 5 מ"ל לתוך אותו צינור 15 מ"ל.
- הוסף 10 מ"ל של מדיה חדשה משלב 2.2 ל- 5 מ"ל הנותרים של מדיה מותנית ותאים בצלוחית. הניחו את הבקבוק שטוח והתבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ אור.
- אם נראה שהתאים נשאפו במהלך איסוף התווך המותנה, סובבו את התווך המותנה ב 100 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להשעות מחדש את כל התאים המצטברים בתחתית ב 1 מ"ל של המדיום מותנה, ולאחר מכן להוסיף אותם לבקבוק התרבית.
- אחסן את 10 מ"ל המדיה הממוזגת שאינה בשימוש משלבים 2.5/2.6 ב- 4 ° C בצינור מכסה בורג של 15 מ"ל.
- חזור על שלבים 1.17/1.18.
3. מעבר hNSC
- אם מרחיבים את ה-NSCs לצלוחיות חדשות, יש לוודא שכל הצלוחיות החדשות מצופות כמו בשלב 1.2.
- נקה את ה- BSC כמו בשלב 2.1, ובצע שלבים 1.4 ו- 1.5.
- הכן בינוני כמו בשלב 1.13. כל בקבוק T75 דורש 10 מ"ל של מדיום. עבור צלוחיות T75 מרובות, הכפל 10 מ"ל של מדיה במספר הצלוחיות.
- הכינו 1 או 3 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (dPBS) וגלוקוז של דולבקו והניחו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס לחימום במשך 10 דקות (לתמיסת טריפסין) בהתאם לנפחים בטבלה 2. אין להוסיף טריפסין או DNase בשלב זה. DNase עשוי להידרש לפרק כל DNA המשתחרר מהתאים המתים עקב דיסוציאציה מכנית או כימית של התא.
הערה: עבור בקבוק T75 אחד שעבר לאחר 9-10 ימים של צמיחה, יהיו בערך 30 × 106 תאים אם 5 × 106 נזרעו במקור על הצלוחית. בדרך כלל, 1 מ"ל של פתרון dPBS משמש עבור 10 × 106 תאים. לכן, 3 מ"ל של פתרון dPBS נדרש עבור בקבוק T75 עובר לאחר 9-10 ימים.
- מניחים סירת שקילה קטנה ונקיה והמוציטומטר במכסה המנוע. נקו עם 70% אתנול והניחו לייבוש באוויר במכסה המנוע למשך כ-5 דקות
הערה: סירת השקילה תשמש בשלבים 3.17.1.
- שלפו את בקבוק התאים שיעברו מהאינקובטור והכניסו ל- BSC. הטו את הבקבוק בעדינות ואפשרו לתאים לשקוע לתחתית המצע המאוגר. יש בערך 15 מ"ל של מדיה בצלוחית.
- הסר כ 10 מ"ל של מדיה בחלקים 5 מ"ל (כלומר 5 מ"ל + 5 מ"ל). הניחו את 10 מ"ל המדיה הזו בצינור נקי של 15 מ"ל שכותרתו "CM" עבור "מדיום מותנה". היזהר לא לשאוף אף אחד מהתאים התיישבו 5 מ"ל הנותרים של מדיה בצלוחית; תאים אלה ו -5 מ"ל של מדיה יהיו כפופים לשלב 3.8.
- קח 3 מ"ל של מדיה מותנית מצינור "CM" (משלב 3.7) והכנס לצינור 15 מ"ל שכותרתו "תמיסת מעכבי טריפסין". פעולה זו תשמש בשלב 3.12. לאחר הסרת 3 מ"ל, נשאר 7 מ"ל של מדיה מותנית בצינור "CM". הניחו את צינור "CM" בצד עד לשלב 3.9.
- הסר את 5 מ"ל המדיה והתאים שנותרו בבקבוק T75 ומניחים בצינור נקי של 15 מ"ל שכותרתו "תאים".
- קח את צינור "CM" המכיל 7 מ"ל של מדיה ממוזגת (משלב 3.7.1) ושטוף את החלק התחתון של בקבוק T75 פעמיים עם חלקים 3.5 מ"ל של מדיה מותנית באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל. לאחר כל שטיפה, מניחים את חלקי 3.5 מ"ל לתוך צינור "תאים". מטרת צעד זה היא להסיר את כל הנוירוספרות (תאים) מבקבוק T75.
- צנטריפוגה את צינור "תאים" ב 100 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בזמן שהתאים מסתובבים, קבל dPBS / תמיסת גלוקוז מאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס והוסף את הכמות המתאימה של טריפסין ו- DNase לפי טבלה 2.
- לאחר שצינור "תאים" הפסיק להסתובב, הסר את כל הסופרנאטנט הבינוני המותנה והעבר לצינור "CM".
- קח את הצינור שכותרתו "תמיסת מעכב טריפסין" משלב 3.7.1. והוסף את נפח מעכב הטריפסין המצוין בטבלה 3. השתמש באותו נפח של תמיסת מעכבי טריפסין ששימש לתמיסת טריפסין.
- יש להכניס את תמיסת מעכבי הטריפסין לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C עד לצורך.
- הוסף תמיסת טריפסין לגלולת התא בצינור 15 מ"ל ופיפטה למעלה ולמטה בערך 5-10 פעמים עם פיפטה 5 מ"ל. סגור את מכסה הצינור ודגור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, לאחזר את התאים פיפטה למעלה ולמטה 5-10 פעמים. לאחר מכן, לדגור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות נוספות.
- ב-5 הדקות האחרונות, העבר את תמיסת מעכב הטריפסין ל-BSC.
- אחזר את התאים לאחר השלמת שלב 2.14 ופשפך את התאים למעלה ולמטה עד שהכדורים מנותקים לחלוטין (20-30 פעמים). לאחר מכן, מיד להוסיף את הפתרון מעכב טריפסין פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים. תמיסה זו של תאים מנותקים ומעכב טריפסין תיקרא "השעיית תאים".
- ספור את מספר התאים בהשעיית התא על-ידי ביצוע השלבים.
- פיפטה 15 μL של תערובת קדם-תערובת של Trypan Blue (המכילה 5 μL של 0.4% Trypan Blue ו-10 μL של dPBS) על סירת שקילה קטנה, ולאחר מכן להוסיף 5 μL של תרחיף התא. פיפטה למעלה ולמטה 3-5 פעמים כדי לערבב. לאחר מכן, פיפטה 10 μL של תרחיף Trypan Blue/cell משני צדי ההמוציטומטר מכוסה בכיסוי זכוכית.
- התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ אור וספרו את מספר התאים הכולל בכל אחת מארבע רשתות הפינות. חברו את המספרים האלה יחד.
- חזרו על הספירה עבור הצד השני וערכו ממוצע של שני הצדדים יחד.
- הכפל מספר זה ב- 10,000 כדי לתת את המספר הכולל של תאים למ"ל. הכפל מספר זה במספר הכולל של מיליליטר כדי לחשב את המספר הכולל של תאים בהשעיית התא. חשב כמה נפח של תרחיף תאים יידרש כדי לזרוע 5 מיליון תאים לכל צלוחיות T75.
הערה: בדרך כלל, לאחר 9-10 ימים, T75 יהיה 25-30 × 106 תאים. לכן, אם מעבירים את כל התאים לצלוחיות חדשות, יש צורך בסך הכל 5-6 צלוחיות.
- הוסף את נפח תרחיף התאים המחושב בשלב 3.19 לכל בקבוק T75 כדי לקבל 5 × 106 תאים לכל בקבוק. אם עוצמת הקול קטנה מ- 5 מ"ל, הוסף מדיום תנאי נוסף כדי להגיע לסך כולל של 5 מ"ל. לאחר מכן הוסף 10 מ"ל של מדיה DFHGFPS חדשה המכילה גורמי גדילה (טבלה 1) לצלוחית.
- חזור על שלבים 1.17 ו- 1.18 וודא שהבקבוק מסומן עם סוג התאים, התאריכים, מספר התאים בצלוחית ומספר המעבר (זהו מספר הפעמים שהתא עבר). לאחר מכן, עבור לשלב 4.
- במידת הצורך, זרעו תאים נוספים לבקבוק T75 אחד בצפיפות של עד 30 × 106 תאים לבקבוק למשך הלילה והקפיאו למחרת בהתאם לשלב 4.
4. hNSC הקפאה ואחסון
- יום לאחר המעבר, שלפו את הבקבוק מהאינקובטור המכיל את התאים להקפאה (משלבים 3.19 ו-3.22). הטה את הבקבוק והסר את כל המדיום והתאים מהבקבוק, ומניחים בצינור של 15 מ"ל. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב 216 x גרם במשך 5 דקות.
- בתהליך הצנטריפוגה הכינו את אמצעי ההקפאה (טבלה 4). עבור כל 5 × 106 תאים, להכין 1 מ"ל של מדיום הקפאה. מספר התאים נקבע בשלב 3.19 כאשר נקבע כמה תאים לשים בכל בקבוק. מספר זה לא ישתנה בן לילה.
- הכינו בקבוקונים לשימור בהקפאה עם תוויות של שם התא, מספר מעבר, מספר תא, ראשי תיבות ותאריך. לאחר הצנטריפוגה, להסיר supernatant על ידי שאיפה ולהשהות מחדש את גלולת התא בתווך הקפאה כך שיש 5 × 106 תאים / מ"ל. באמצעות פיפטה 5 מ"ל, aliquot 1 מ"ל לכל בקבוקון אוטם היטב (5 × 106 תאים לכל בקבוקון).
- מניחים בקבוקונים במיכל שימור קריו-שימור עם 250 מ"ל של איזופרופנול (השימוש המרבי הוא 5 פעמים לכל החלפה של איזופרופנול). יש לאחסן במקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה, ולאחר מכן להעביר למערכת אחסון מיכל חנקן נוזלי.
5. ציפוי hNSC דבק לאימות
- יום לפני המעבר (שלבים 3.1-3.22), לנקות את BSC כמו בשלב 2.2 ולקבל צלחת 24 באר זכוכית סטרילית 12 מ"מ מכסה מחליקים.
- בעזרת מלקחיים, מניחים מכסה יחיד בתחתית כל באר של הצלחת.
- מצפים את הבארות המכילות כיסויים עם 0.01% פולי-D-ליזין (PDL) במים סטריליים ולדגור במשך שעה אחת ב 37 ° C. עבור צלחת 24 באר, להשתמש 250 μL של PDL לכל באר.
- הסר את PDL מהבארות, ולאחר מכן לצפות אותו עם 1 מיקרוגרם / cm2 laminin / dPBS (250 μL לכל באר). לדגור את הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס. אם אין צורך למחרת, אטמו את הצלחת בפרפילם על ידי עטיפת הפרפילם סביב שולי הצלחת ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.
הערה: צלחות מצופות בלמינין ניתן לאחסן עד 2 שבועות אם אטום עם parafilm כל עוד מכסה לא מתייבש.
- תאי מעבר כמתואר בשלבים 3.1-3.22, ולאחר מכן לקבוע את מספר התאים שיש לזרוע לתוך צלחת 24 בארות עם כיסויים מצופים.
- הסר כל תמיסת למינין עודפת מבארות באמצעות שאיפה, ושטוף פעם אחת עם 0.5 מ"ל של dPBS. לאחר מכן, זרעו תאים לתוך הבארות בצפיפות של 0.6-1 x 105 תאים / ס"מ2 לכל באר. השתמש בתאים הנותרים בהתאם לשלבים 3.16-3.21.
- בזמנים שונים במהלך תרבית צלחת 24 בארות, לתקן ולהכתים את התאים עבור סמנים שונים של תאי גזע.