$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. יצירת צברי iPSC
- יצירת תרביות חד-תאיות חד-שכבתיות ממושבות iPSC
- הכינו פלטת 6 בארות מצופה תמצית קרום מרתף (BME). הפשירו BME על הקרח בטמפרטורה של 4°C למשך 2-3 שעות, דיללו אותו ב-Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12; דילול 1:50) של Dulbecco), כסו את הצלחת ב-1 מ"ל/באר של תמיסת ה-BME המדוללת, ואחסנו את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- יש לשאוף את המדיום ולשטוף מושבות iPSC שלמות של לפחות שתי בארות של צלחת בעלת 6 בארות עם 0.5 mM EDTA במי מלח חוצצי פוספט (PBS) פעמיים לפני הדגירה על מושבות עם 0.5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ב-PBS למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT). יש לשאוף לתמיסת EDTA ולנתק בעדינות את המושבות על ידי שטיפתן מתחתית הצלחת עם 5 מ"ל של מדיום DMEM-F12. אסוף אותם בצינור של 15 מ"ל ושלח אותם בצנטריפוגה (4 דקות ב 1,200 x גרם ב- RT).
הערה: iPSCs שתוכנתו מחדש מפיברובלסטים הזמינים מסחרית שימשו בהצלחה.
- שאפו את הסופרנאטנט ודגרו על מושבות iPSC עם 500 μL של מגיב דיסוציאציה של תאים למשך 6 דקות ב-37°C.
- טפחו את תרחיף התא מספר פעמים בעדינות למעלה ולמטה עם פיפטה של 1 מ"ל כדי לפרק את אשכולות התאים הנותרים לתאים בודדים.
- הוסף 4 מ"ל של DMEM-F12 לתרחיף התא כדי לדלל את מגיב הדיסוציאציה של התא.
- סובב את התאים כלפי מטה במהירות של 1,200 x גרם למשך 4 דקות ב- RT.
- להשהות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של מדיום iPSC בתוספת 5 מיקרומטר Y-27632 ותאי זרע לתוך באר אחת של צלחת 6 באר מצופה BME.
הערה: השתמש בתווך iPSC שצוין בטבלת החומרים עבור תרביות iPSC חד-שכבתיות חד-שכבתיות.
- למחרת, החלף את המדיום בתווך iPSC טרי חסר Y-27632. מנקודה זו, המשיכו לתרבית את התאים, משנים את המדיום כל יום עד שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הם 100% מתמזגים. בהתאם לקו התא ואת המפגש של בארות ההתחלה, זה ייקח בין 2-4 ימים.
- לאחר המפגש, לעבור את iPSCs. לשאוף בינוני ולהחיל 500 μL של מגיב דיסוציאציה התא על התאים.
- לדגור על התאים במשך 5-10 דקות ב 37 ° C. נענע בעדינות את הצלחת כדי לנתק את התאים.
- לשטוף את התאים מן הבאר באמצעות 2 מ"ל של DMEM-F12 ולאסוף אותם בצינור 15 מ"ל. הוסף DMEM-F12 לנפח כולל של 5 מ"ל.
- סובבו את התאים במהירות של 1,200 x גרם במשך 4 דקות ב-RT ושאפו את הסופר-נטנט.
- זרעו את התאים בתווך iPSC בתוספת 5 מיקרומטר Y-27632 ביחס של 1:2 עד 1:4 על צלחת 6 בארות מצופה BME (2 מ"ל/באר בינונית).
- המשיכו לתרבית התאים במשך 2-5 ימים והחליפו מדיום iPSC חסר Y-27632 מדי יום. לאחר המפגש, מעבר iPSCs (שלבים 1.1.4-1.1.8).
הערה: תרבית את ה- iPSCs עבור לפחות 2 מעברים כשכבה אחת בתווך iPSC המצוין בטבלת החומרים לפני השימוש בהם ליצירת אגרגטים iPSC כדי לאפשר לתאים להסתגל לתנאי התרבית.
- השתמש בתרביות iPSC חד-שכבתיות כאשר הן נפגשות ב-70-90% ליצירת אגרגטים iPSC.
הערה: iPSC מותאם לתנאי התרבית מכיוון שתאים בודדים נוטים פחות ללחץ שמוביל למוות תאים במהלך הליך הדיסוציאציה והצבירה. תרביות iPSC חד-שכבתיות צריכות להציג מורפולוגיה פלוריפוטנטית טיפוסית ללא עדות להתבדלות. בדוק את התרביות על בסיס קבוע עבור זיהום מיקופלסמה. עבוד רק עם תרביות iPSC נטולות מיקופלסמה.
- שאפו את מדיום התרבית מבאר אחת של צלחת בעלת 6 בארות והניחו 500 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה של תאים על התאים.
- לדגור על התאים במשך 5-10 דקות ב 37 ° C. נענע בעדינות את הצלחת כדי לנתק את התאים.
- לשטוף תאים מן הבאר באמצעות 2 מ"ל של DMEM-F12 ולאסוף אותם בצינור 15 מ"ל. הוסף DMEM-F12 לקבלת נפח כולל של 10 מ"ל.
- לספירת תאים, קחו 25 μL מתרחיף התא וערבבו אותו עם 25 μL של טריפאן כחול כדי לסמן תאים מתים. ספרו את התאים החיים באמצעות תא ספירה.
- אסוף מספיק תאים (4,500 תאים לכל צבר iPSC) מתרחיף התא בצינור של 15 מ"ל.
- סובבו את התאים במהירות של 1,200 x גרם במשך 4 דקות ב-RT ושאפו את הסופר-נטנט.
- השהה מחדש את התאים בנפח מתאים של מדיום iPSC בתוספת 50 מיקרומטר Y-27632 כדי לקבל 4,500 תאים חיים לכל 150 μL.
הערה: שימוש בריכוז גבוה של Y-27632 (50 מיקרומטר) הוא קריטי להישרדותם של תאי גזע פלוריפוטנטיים מוגנים.
- צלחת 150 μL בכל באר של צלחת U-bottom 96-well בעלת חיבור נמוך ומניחים אותה באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
הערה: בעת יצירת אגרגטים iPSC, קח בחשבון כי לפחות 6 אורגנואידים נדרשים לבקרת איכות ביום 20 (ראה סעיף 5).
2. אינדוקציה של נוירואקטודרם קדמי
- עקוב מקרוב אחר השינויים במורפולוגיה של צברי iPSC מדי יום תחת מיקרוסקופ תרבית הרקמה באמצעות עדשת הספק 4X או 10X. התבונן ביום הראשון, צברי תאים עם גבולות ברורים. המשך לתרבית אגרגטים iPSC בחממה ב 37 ° C ו 5% CO2.
הערה: מספר מסוים של תאים מתים / באר הוא נורמלי ולא ישפיע על ייצור אורגנואידים.
- הזינו את אגרגטי iPSC החל מהיום השני והמשיכו עם כל יומיים על ידי שאיפה עדינה של כ-2/3 מהתווך מבלי להפריע לצברי התאים בתחתית. הוסף 100 μL נוספים של iPSC בינוני חסר Y-27632.
הערה: בתוך 4-6 ימים צברי התאים יהיו בקוטר 350-450 מיקרומטר ויציגו קצוות חלקים.
- בשלב זה, אגרו את צברי התאים עם קצה פיפטה חתוך של 100 מיקרוליטר לצלחת דלת חיבור של 6 ס"מ (מקסימום 20 אגרגטים לצלחת) בתווך אינדוקציה קורטיקלית המכיל DMEM-F12 עם תוסף N2 (1:200), תוסף B27 (1:100), גלוקוז (0.2 מ"ג/מ"ל), אדנוזין מונופוספט מחזורי (cAMP; 0.15 מיקרוגרם/מ"ל), 0.5% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 1% L-אלניל-L-גלוטמין, הפרין (10 מיקרוגרם/מ"ל), והתרכובות LDN-193189 (180 ננומטר), A83-01 (500 ננומטר) ומעכב תגובת Wnt-1 (IWR-1) (10 מיקרוגרם/מ"ל). להאכיל את צברי התאים על ידי שינוי מדיום אינדוקציה קליפת המוח 3 ימים לאחר העברתם לצלחת 6 ס"מ.
- עקוב מקרוב אחר שינויים מורפולוגיים במהלך השראת קליפת המוח תחת מיקרוסקופ תרבית הרקמה באמצעות עדשת כוח 4X.
הערה: לאחר 4-5 ימים בתווך אינדוקציה קליפת המוח, קצוות של אגרגטים התא צריך להתחיל להתבהר על פני השטח, המציין התמיינות neuroectodermal. בשלב זה, ארגון רדיאלי של אפיתל pseudostratified מתגלה. המשך לסעיף 3 כדי להטביע את צברי התאים במטריצת BME.
3. הטבעה של אגרגטים נוירואקטודרמליים בפיגום מטריצה
- הפשיר BME על קרח ב 4 ° C במשך 2-3 שעות. Aliquot BME לא מדולל בכמויות מספיקות.
- הכינו יריעת סרט פרפין מפלסטיק להליך ההטבעה. חותכים את סרט הפרפין מפלסטיק באמצעות מספריים סטריליים לחתיכות גדולות בגודל 4X4 ס"מ, מניחים חתיכה מסרט הפרפין מפלסטיק מעל מגש קצה ריק של 100 μL לקצוות של 100 μL, ולוחצים עם אצבע בכפפה כך שייווצרו גומות קטנות ביריעת סרט הפרפין מפלסטיק (יש צורך בגומה אחת/צבר תאים). נקו את יריעת הפרפין מפלסטיק עם 70% אתנול והקרינו אותה באור UV (הספק: 15 וואט, אורך גל: 435 ננומטר) מתחת לספסל הסטרילי הסגור למשך 30 דקות.
- מעבירים כל צבר תא לגומה אחת של יריעת סרט הפרפין מפלסטיק באמצעות קצה חיתוך של 100 μL עם פתח בקוטר 1.5-2 מ"מ. במקרה ששני צברי תאים מתמזגים, אל תפרידו ביניהם אלא תעבירו אותם יחד לגומה אחת.
- שאפו בעדינות את התווך המקיף את צברי התא באמצעות קצה פיפטה לא חתוך של 100 μL.
הערה: היזהר לא למצוץ את צברי התא לתוך הקצה, שכן זה יפגע אגרגטים.
- הוסף 40 μL של BME לא מדולל לכל צבר תא.
- מקם כל צבר תאים באמצע טיפת BME באמצעות קצה פיפטה לא חתוך של 100 μL.
הערה: היזהר מאוד לא לפגוע neuroepithelium מתפתח עם קצה פיפטה.
- מעבירים בזהירות את יריעת סרט הפרפין מפלסטיק באמצעות מלקחיים סטריליים לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ (או צלחת תרבית תאים מספקת אחרת) ומניחים את המנה באינקובטור למשך 15-20 דקות כדי לאפשר ל-BME להתמצק.
- בינתיים, להכין צלחת חיבור נמוך 6 ס"מ המכיל 5 מ"ל של מדיום אינדוקציה קליפת המוח.
- לאחר פילמור של BME, להסיר את טיפות המכילות את אגרגטים התא מן גיליון הסרט פרפין פלסטיק. בעזרת מלקחיים סטריליים, הופכים את סרט הפרפין מפלסטיק וסוחטים בעדינות את אגרגטי התאים לתוך צלחת בעלת חיבור נמוך של 6 ס"מ (כ-30°) עם הטיה קלה (כ-30°) עד שהטיפות נופלות מיריעת סרט הפרפין מפלסטיק. מעבירים עד 16 צברי תאים לצלחת אחת בקוטר 6 ס"מ.
- המשך לדגור על צברי התאים ב 37 ° C.
4. יצירת אורגנואידים מסוג המוח הקדמי מאגרגטים נוירואקטודרמליים
- יום לאחר ההטבעה במטריצת BME, הניחו צלחות תרבית אורגנואידים על שייקר תרבית תאים נדנדה עם זווית הטיה של 5 ° ו -14 סל"ד, המותקן באינקובטור תרביות תאים.
- עקוב אחר אורגנואידים מדי יום. מבנים הומוגניים דמויי לולאה נוירואפיתל מתפתחים בהדרגה לאחר הטבעה במטריצת BME.
- כאשר מבני לולאה נוירואפיתליאליים גלויים, שנה את המדיום למדיום התמיינות אורגנואידי המכיל DMEM-F12 עם תוסף N2 (1:200), תוסף B27 (1:100), גלוקוז (0.2 מ"ג / מ"ל), cAMP (0.15 מיקרוגרם / מ"ל), 0.5% NEAA, 1% L-alanyl-L-גלוטמין, אינסולין (2.5 מיקרוגרם / מ"ל)
- החלף את מדיום התמיינות האורגנואיד כל 3-4 ימים עד שתגיע לנקודת זמן ההתמיינות הרצויה. לאחר מכן, תקן אורגנואידים (ראה סעיף 5).
הערה: לעיתים, הרקמה עשויה להציג ניצנים של רקמה שקופה אופטית ללא מבני לולאה. למרות שזה לא אידיאלי, זה לא משפיע על התפתחות של מבנים קליפת המוח. ניתן לגדל את האורגנואידים בתרבית בתווך התמיינות אורגנואידים למשך עד 40 יום. לתקופות תרבית ממושכות (40-100 ימים) ניתן להשלים את מדיום התמיינות האורגנואידים עם 1:50 BME כדי להגדיל את מורכבות הרקמות, ועם BDNF ו- GDNF כדי לאפשר הישרדות והתבגרות עצבית.