$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת החומרים הדרושים לתרבות iPSC ובידול BEC.
- ציפוי מטריצה של פלסטיק תרבית רקמה (TC) לתרבית IMR90-4 iPSC
- Aliquot מרתף ממברנה מטריקס ג'ל (למשל, Matrigel) לתוך 2.5 מ"ג aliquots ולאחסן ב -20 °C.
הערה: עבוד במהירות בעת טיפול ג'ל מטריצה aliquot על קרח, כפי שהוא יוצר ג'ל מעל 4 ° C ולא ניתן aliquoted לאחר שהוא התמצק.
- לציפוי פלסטיק TC, הוסף במהירות aliquot אחד של ג'ל מטריצה ל- 30 מ"ל של מדיום הנשר השונה (DMEM) / F12 בינוני של Dulbecco בצינור חרוטי של 50 מ"ל. מוסיפים 1 מ"ל של המדיום על ג'ל המטריקס הקפוא, פיפטה למעלה ולמטה עד שהוא מופשר, ומעבירים מיד לצינור החרוטי 50 מ"ל עם המדיום הנותר.
- השתמש 1 מ"ל של תמיסת ציפוי ג'ל מטריצה זו לכל באר של צלחת 6 בארות ו 12 מ"ל לכל צלוחיות T75.
הערה: פלסטיק TC מצופה ג'ל מטריקס ניתן להכין עד שבועיים לפני השימוש בו. עם זאת, קריטי להימנע מכך, תמיסת ג'ל המטריצה מתייבשת, מה שעשוי לדרוש מדי פעם תוספת של DMEM/F12 נוסף על גבי הבארות.
- הכן מדיום תחזוקת תאי גזע על ידי הוספת 50 מ"ל של תוספת 50x ל 450 מ"ל של תווך בסיסי לתחזוקת תאי גזע בסביבה סטרילית של ארון בטיחות ביולוגית.
- להכנת 500 מ"ל של מדיום לא מותנה (UM), ערבבו 392.5 מ"ל של DMEM/F12 עם 100 מ"ל של תחליף סרום נוק אאוט (KOSR), 5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות, L-גלוטמין בריכוז סופי של 1 מילימול, ו-3.5 מיקרוליטר של β-מרקפטואתנול. יש לסנן-לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
- כדי להכין 200 מ"ל של תאי אנדותל (EC) בינוניים בתוספת חומצה רטינואית (RA) בתוספת bFGF, שלבו 198 מ"ל של מדיום ללא סרום אנדותל אנושי (hESFM), 2 מ"ל של סרום נגזר מעוקר טסיות (PDS) ו-20 ננוגרם/מ"ל bFGF. יש לסנן, לעקר ולאחסן עד שבועיים ב-4°C. ממש לפני התוספת לתאים, הוסף 10 מיקרומטר של RA ל- EC medium.
הערה: מכיוון ש-PDS הופסק ולכן עשוי להיות מוגבל, פרוטוקול זה בוצע בהצלחה באמצעות B27 במקום PDS.
- כדי להכין 200 מ"ל של מדיום EC ללא RA או bFGF, שלב 198 מ"ל של hESFM ו -2 מ"ל של PDS מעוקר מסנן ועיקור מסנן. יש לאחסן עד 4 שבועות בטמפרטורה של 4°C.
2. התמיינות של תאי אנדותל במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים
- ציפוי iPSCs לבידול (יום -3 של פרוטוקול הבידול)
- לכל תרבית תחזוקה IMR90-4 המשמשת היטב לצלחת להתמיינות, לשאוף את מדיום התרבית, להוסיף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה תאים אנזימטי לכל באר, ולדגור ב 37 ° C במשך 7 דקות.
- נטרל את מגיב הדיסוציאציה האנזימטי של התאים על ידי העברת 1 מ"ל של תרחיף תאים מנותק לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל עם לפחות 2 מ"ל של אמצעי תחזוקה טריים של תאי גזע לכל 1 מ"ל של תאים. סובב את מתלה התא במהירות של 1,500 x גרם למשך 5 דקות.
- להשהות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה של תאי גזע לכל באר של תאי IMR90-4 בשימוש, ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
הערה: ייתכן שיהיה מועיל לדלל 1:1 עם 0.4% טריפאן כחול כדי להבחין בין תאים חיים ומתים בעת ספירה. בהתאם לצפיפות של iPSCs, באר אחת של צלחת 6 בארות מניבה בדרך כלל 1\u20122 x 106 תאים.
- להתמיינות בצלוחית T75, יש להוסיף 7.5 x 105 תאים ל-12 מ"ל של מדיום תחזוקת תאי גזע ומעכב ROCK (Y27632 דיהידרוכלוריד) בריכוז סופי של 10 מיקרומטר. תמיסת ציפוי ג'ל מטריצה שואפת מבקבוק T75 ומעבירים את תרחיף התא לצלוחית. יש לפזר את התאים באופן שווה על ידי ניעור הבקבוק קדימה ואחורה ומשמאל לימין ולדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
הערה: זה קריטי להוסיף מעכב ROCK בשלב זה כדי לשפר את ההישרדות של תאי גזע בודדים מנותקים. התאים צריכים להיות מפוזרים באופן שווה על פני הבקבוק ובסינגלים המציגים מורפולוגיה מפוזרת, דמוית מזנכימלי עקב הטיפול במעכבי ROCK.
- ביום -2 וביום -1, החליפו את המדיה למדיום תחזוקת תאי גזע טריים; 12 מ"ל לכל T75.
- ביום 0, התחל בידול על ידי שינוי מדיה ל- UM; 12 מ"ל לכל T75.
- שנה UM מדי יום (יום 1 - יום 5).
הערה: התאים בדרך כלל מגיעים למפגש לאחר 2 עד 3 ימים ב- UM, אשר ניתן לצפות בעין בלתי או דרך מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך. ככל שההתמיינות מתקדמת, "מערכות עצביות" של nestin+ הופכות גלויות עם תאי PECAM-1+ ביניהם.
- להרחיב באופן סלקטיבי את אוכלוסיית תאי האנדותל על ידי מעבר לתווך EC עם 20 ננוגרם/מ"ל bFGF ו-10 מיקרומטר חומצה רטינואית (RA) (יום 6) ודגרה במשך יומיים. EC בינוני עם bFGF ניתן להכין עד שבועיים לפני. RA מתווסף ממלאי קפוא ביום השימוש (למשל, 1 μL של 10 mM מלאי RA לכל 1 מ"ל של EC + bFGF).
הערה: התמיינות מוצלחת יכולה להיות מושגת גם ללא תוספת של RA בימים 6 ו -8. עם זאת, השמטת RA תניב BECs עם TEER מופחת.
- ציפוי צלחות תרבית תאים ותוספות קרום (למשל, Transwell) עם קולגן IV ופיברונקטין (יום 7), לטיהור BECs ולאחר ניסויים.
- לציפוי של תוספות ממברנה, ערבבו 4 חלקים קולגן IV (1 מ"ג/מ"ל ב-0.5 מ"ג/מ"ל חומצה אצטית), חלק אחד פיברונקטין (1 מ"ג/מ"ל) ו-5 חלקים מים סטריליים באיכות רקמה. ניתן לדלל את תמיסת ECM ביחס של 1:5 לציפוי לוחות תרבית תאים (כלומר, 4 חלקים קולגן IV, חלק אחד פיברונקטין ו-45 חלקים מים). יש לדגור עם תמיסת ציפוי בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
הערה: ניתן גם לצפות צלחות ותוספות קרום במשך 4 שעות לפחות לפני תרבית משנה באותו יום של שלב הטיהור.
- לטהר BECs על ידי subculturing התאים ממוינים על קולגן IV לוחות מצופים פיברונקטין או תוספות ממברנה (יום 8).
- לשאוף EC בינוני ולהוסיף מגיב דיסוציאציה תאים אנזימטי (12 מ"ל לכל T75). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עד ש-90% מהתאים התנתקו מהבקבוק.
הערה: דיסוציאציה של תאים יכולה להימשך עד שעה אחת.
- בזמן הדגירה, הסירו את תמיסת ציפוי הקולגן IV/פיברונקטין מצלחות/תוספות שהוכנו בעבר והניחו להן להתייבש במכסה מנוע סטרילי. לוקח בערך 20 דקות לתוספות להתייבש.
- לאחר ניתוק התאים, שטפו אותם מהבקבוק באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. פיפטה למעלה ולמטה כדי להשיג השעיה של תא יחיד.
הערה: תרחיף תא בודד חשוב לספירת תאים אמינה ולהשגת חד-שכבות מוצקות.
- לדלל עם לפחות נפח שווה של hESFM טרי בצינור חרוטי 50 מ"ל ולספור תאים באמצעות המוציטומטר.
- מטילים את התאים על 1,500 x גרם במשך 10 דקות.
- תאי השעיה בנפח מתאים של EC + bFGF + RA טריים שהוכנו כדי להשיג השעיה של 2 x 106 תאים/מ"ל לזריעה על תוספות ממברנה. הוסף 500 μL (1 x 106 תאים) על גבי תוספת 12 בארות ו 1.5 מ"ל של EC + bFGF + RA בינוני בתחתית. לזריעה על לוחות 24 ו -48 בארות, לדלל את תרחיף התאים 1: 2 ולהוסיף 500 μL (5 x 105 תאים) ו 250 μL (2.5 x 105 תאים) לכל באר, בהתאמה. לפזר תאים באופן שווה על פני הבאר / להכניס ולדגור ב 37 ° C תחת 5% CO2.
- שנה מדיה על צלחות/טרנסוולים ל- EC ללא bFGF או RA (יום 9).