בידוד תאי גזע שמקורם בשומן מרקמת שומן פריאורטית מורין

תקציר

מקור: Qi, Y., et al. בידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של תאי גזע מקוריים שמקורם בשומן עצבי מרקמת שומן פריאורטית. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) המסומנים באופן פלואורסצנטי מרקמת השומן של קשת פריאורטית. לאחר הבידוד, NCADSCs מזוהים, ממוינים באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ולאחר מכן תרבית על צלחת, קידום התפשטות תאים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. בידוד של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF)

אספו את רקמת השומן של קשת פריאורטית (PAAT) של 5-6 עכברים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה אחד של 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל מדיום עיכול טרי מוכן וטחנו את הרקמה באמצעות מספריים כירורגיים בצינור אפנדורף בטמפרטורת החדר (RT).

1. מעבירים את התערובת לתוך צינורות 50 מ"ל המכילים 9 מ"ל של מדיום העיכול. הומוגניזציה של הרקמות על ידי pipeting למעלה ולמטה עם פיפטה 1 מ"ל 10x.
2. יש לדגור על הצינורות בטמפרטורה של 37°C עם רעידות קבועות ב-100 סל"ד למשך 30-45 דקות ולבדוק כל 5-10 דקות כדי למנוע עיכול יתר. זה קריטי לשיפור הכדאיות והתשואה של התא.
   הערה: עיכול רקמות טוב יגרום לרקמת שומן הומוגנית, צהובה בהירה הנראית לעין בלתי בעת ערבול עדין של הצינור.
3. עצור את העיכול על ידי הוספת 5 מ"ל של HDMEM המכיל 10% FBS ו 1% v/v PS ב RT ולערבב היטב על ידי pipetting.
4. צנטריפוגה את מתלה התא ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב RT. ה- SVF ייראה כגלולה חומה. שאפו בזהירות את האדיפוציטים הצפים ודקרו את הסופרנאטנט שנותר מבלי להפריע ל-SVF. ממיסים את כדורית SVF ב-10 מ"ל של מדיום תרבית ומסננים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר.
5. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 500 x גרם במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, ובעדינות להשעות מחדש את הגלולה ב 5 מ"ל של חיץ אריתרוציטים ליזה בצינור חרוטי 15 מ"ל במשך 10 דקות ב RT.
6. עצור את התגובה על ידי הוספת 10 מ"ל של 1x PBS המכיל 1% FBS. צנטריפוגה את מתלה התא ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, להסיר את supernatant, ולהשהות מחדש את הגלולה ב 10 מ"ל של 1x PBS המכיל 1% FBS.
7. צנטריפוגה את התאים שוב ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להסיר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 5 מ"ל של מדיום תרבית בצינור חרוטי 15 מ"ל ב 4 ° C.
8. לאחר סבב אחרון של צנטריפוגה (500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C), להשהות מחדש את התאים גלולות 5 מ"ל של חיץ FACS (PBS המכיל 10% FBS, 100 יחידות / mL DNA I, ו 1% v/v PS) על קרח, ולספור את התאים עם המוציטומטר.

2. בידוד NCADSCs על ידי FACS

1. הגדר ומטב את סדרן התאים בהתאם למדריך ההוראות. בחר את זרבובית 100 מיקרומטר, עיקור את צינורות האיסוף, התקן את התקן האיסוף הנדרש והגדר את הזרמים הצדדיים.
2. למיון תאי RFP+ מומלץ להשתמש בלייזר צהוב/ירוק 561 ננומטר ובמסנן אופטי 579/16. בצע את הפיצוי באמצעות הבקרה השלילית והבקרות החיוביות המוכתמות היחידות. ראו איור 1A עבור סכימת הגאט.
3. סנן את התאים דרך מסננת 40 מיקרומטר, צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות, והשהה אותם מחדש ב 2 מ"ל של חיץ FACS בצפיפות של 0.5-1 x 10⁷/מ"ל. העבירו את התאים לצינורות פוליסטירן בעלי תחתית עגולה של 5 מ"ל המסומנים בבירור והעמיסו אותם למיון.
4. הפעל את צינור הדגימה הניסיוני ב- 4 ° C, הפעל את לוחות הסטייה ומיין לצינור חרוטי 15 מ"ל מצופה מראש בסל"ד המכיל 1% FBS ו- 1% v/v PS.
   הערה: הגן על הדגימות מפני אור חזק כדי למזער את מרווה RFP.

3. תרבות של NCADSCs

1. לוחים את התאים הממוינים בצפיפות של 5,000 תאים לסמ"ק² בצלחת תרבית של 12 בארות בתווך תרבית שלם ודגרים בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה עם 5%_CO2 למשך 20-24 שעות.
2. הסר את מדיום התרבית, שטוף את התאים עם PBS שחומם מראש (37 ° C) כדי להסיר פסולת התא, ולהוסיף מדיום תרבית טרי.

תוצאות

איור 1: התמיינות אדיפוגנית של NCADSCs שבודדו מ-PAAT. (A) תכנית כללית לאפיון ומיון אוכלוסיות NCADSCs (RFP). (B) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראות שה-NCADSCs נצמדו והתרחבו לאחר זריעה של 96 שעות על צלחת תרבית של 12 בארות. (ג-ג) תמונות מייצגות המראות כי O אדום שמן הכתים NCADSCs מ PAAT לאחר אינדוקציה אדיפוגנית. (ג) בקרה (ללא אינדוקציה). ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BSA	VWR מדעי החיים	0332-100 גרם	50 מ"ג / מ"ל ריכוז עבודה; פריט #: 0536C008
קולגנאז, סוג I	גיבקו	17018029
חיץ אריתרוציטים ליזיס	Invitrogen	00-4333
פ.ב.ס.	קורנינג	R35-076-CV	50 מ"ג / מ"ל ריכוז עבודה; הרבה #: R2040212FBS
HBSS	גיבקו	14025092
HDMEM	מדעי החיים	SH30243.01	פריט #: AD20813268
PBS (מלח חוצץ פוספט)	ABCONE (סין)	P41970
פניצילין-סטרפטומיצין	גיבקו	15140122