בידוד תאי גליה אנטריים מהתת-רירית והלמינה פרופריה של עכבר

תקציר

מקור: Wang, Z. et al., בידוד תאי גליה אנטריים מהתת-רירית והלמינה פרופריה של העכבר הבוגר.J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי גליה אנטריים מהתת-רירית והלמינה פרופריה של מעי העכבר. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בחילוץ רקמה תת-רירית ולמינה פרופריה, בידוד תאי הגליה האנטרית מהם, וטיפוח התאים על צלחת באר מצופה כדי להקים תרבית תאי גליה אנטריים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנת תמיסות פולי-D-ליזין סטריליות (PDL) ולמינין

1. לפחות יום אחד לפני בידוד תאים, הכינו פולי-D-ליזין (PDL) וצלחות מצופות למינין.
   הערה: הן צלחות 6 באר והן 12 בארות הוכנו בהתאם למטרות הניסוי. בדרך כלל, לוחות 12 בארות שימשו לניתוח כמותי באמצעות כתמים מערביים, בעוד לוחות 6 בארות שימשו להחזקת כיסויים אוטוקלאביים (סטריליים) עבור אימונוהיסטוכימיה. לוחות 24 בארות שימשו לתרבית תאי גליה אנטריים (EGCs) עבור הדמיית שטף Ca²⁺.
2. יש לדלל תמיסות מלאי עם תרבית רקמה טהורה במיוחד, מים נטולי DNase ו-RNase במכסה מנוע של תרבית רקמה עם אוויר מסונן HEPA.
3. חיטוי כיסויי זכוכית
   1. החזיקו את הכיסוי במלקחיים סטריליים וטבלו את הכיסויים בכוס של 100% אתנול למשך 15 דקות. הניחו לאתנול להתאדות במכסה המנוע של תרבית הרקמה ולאחר מכן הניחו אותו בצלחות 6 בארות.
   2. לחלופין, הניחו מספר כיסויים בנפרד על נייר ניקוי בעובי 2 מ"מ במיכל פלסטיק ולאחר מכן autoclave.

2. ציפוי צלחות

הערה: בצע שלבים אלה תחת מכסה מנוע זרימה למינרית סטרילית של תרבית רקמה.

1. יש להפשיר 1 מ"ג/מ"ל PDL ולדלל ביחס 1:10 במים סטריליים בדרגת תרבית רקמה, כך שהריכוז הסופי הוא 100 מק"ג/מ"ל. השתמש 2 מ"ל לכל באר כדי לצפות צלחות 6 בארות, 1 מ"ל כדי לכסות באר אחת של צלחת 12 בארות, ו 0.5 מ"ל עבור באר אחת בלוחות 24 בארות. לאחסן את PDL מדולל הנותר ב 12 מ"ל aliquots ב -20 ° C.
2. לאחר מתן אפשרות ל-PDL לצפות את הבארות למשך שעה אחת לפחות, הסירו את ה-PDL עם פיפטה סטרילית. אפשר לצלחות להתייבש לחלוטין תחת מכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית רקמה.
   הערה: לאחר הסרת תמיסת PDL עם פיפטה סטרילית, ניתן להשתמש בה פעמיים נוספות תוך שבוע לאחר שעבר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ואחסון ב -4 מעלות צלזיוס.
3. הפשירו את ציר הלמינין על קרח כדי למנוע היווצרות ג'ל.
   הערה: למינין לא מדולל הופך מוצק כאשר מחממים מעל 8 °C (75 °F).
4. יש לדלל את ציר הלמינין (0.5 מ"ג/מ"ל) ביחס 1:50 עם מלח חוצץ פוספט (DPBS) סטרילי של Dulbecco לקבלת ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל. לאחסן את laminin מדולל ב 12 מ"ל aliquots ב -20 ° C.
5. מוסיפים למינין מדולל לבארות המכילות PDL מיובש. השתמש 1 מ"ל כדי לכסות את פני השטח 6 בארות ו 0.5 מ"ל כדי לכסות את החלק התחתון של לוחות 12 באר. עבור כיסויים, הוסף 400 μL של למינין מדולל לכיסויים כדי להשיג כיסוי פני השטח.
6. לדגור על הלוחות המצופים ב 37 ° C במשך 2 שעות, אם הצלחת משמשת באותו יום (ציפוי מהיר). אם לא, אטמו את הצלחות בניילון נצמד ואחסנו אותן למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C (ציפוי איטי).
   הערה: האיטום הוא קריטי כדי למנוע התייבשות וזיהום.
7. הסר את תמיסת הלמינין בזהירות עם פיפטה כדי למנוע שריטה של פני השטח. לשטוף בעדינות את הבארות שלוש פעמים עם DPBS סטרילי.
8. הוסף מצע גליה שלם לכל באר ושמור על הלוחות ב 37 ° C עד מוכן להוסיף את מתלה EGC.
   הערה: פולי-D ליזין וצלחות מצופות למינין ניתן לאחסן במשך 3 ימים ב 4 ° C. לצפות את הצלחות כמה ימים קדימה ולאחר מכן לאחסן ב 4 °C; שטפו את הצלחות עם מלח חוצץ פוספט סטרילי של דולבקו (DPBS) שלוש פעמים. הוסף 2 מ"ל של DPBS סטרילי לכל באר לאחר הכביסה הסופית. אטמו את הצלחת עם פרפילם ואחסנו בטמפרטורה של 4°C. זה חיוני כדי להבטיח כי laminin לא להתייבש.

3. הכנת פתרונות בידוד

1. הכן את פתרון הדיסוציאציה EDTA/HEPES/DPBS. עבור 500 מ"ל של התמיסה, השתמש DPBS סטרילי (ללא סידן ומגנזיום) כדי לעשות פתרון סופי של 10 mM HEPES ו 5 mM EDTA. ל- 490 מ"ל של DPBS, הוסף 5 מ"ל של מאגר HEPES של 1 M ו- 5 מ"ל של תמיסת מלאי EDTA של 0.5 M. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
2. הכינו את אמצעי התרחיף של תאי הגליה באמצעות הריאגנטים המפורטים בטבלה 1.
3. הכינו מצעי גדילה גליה באמצעות ריאגנטים המפורטים בטבלה 2.
   הערה: ניתן לאחסן מדיה לגידול גליה המכילה GDNF למשך שבוע ב -4 מעלות צלזיוס.

4. הסרת קטע המעי

הערה: לעכברים הותרה גישה חופשית למזון ומים לפני המתת חסד בשיטת טיפת איזופלורן והסרת איבר חיוני. נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 מעל גיל 8 שבועות. שני המינים שימשו ללא הבדלים ניכרים בהכנה.

1. הרדימו את העכבר עם מנת יתר של איזופלורן והניחו אותו בשכיבה במגש ניתוח. הצמידו את הגפיים ועיקרו את הבטן עם 70% אתנול. אוהל את העור עם מלקחיים ולאחר מכן לפתוח את הבטן עם מספריים.
2. הרימו את הכבד וזהו את הקיבה/פילורוס הדיסטלי. לאחר מכן, להסיר 7 ס"מ של המעי הפרוקסימלי. היזהר לא לקרוע את המעי.
3. החזיקו את הפילורוס במלקחיים תוך כדי חיתוך המזנטריה.
   1. השתמש בדיסקציה קהה עם גב המספריים כדי לגרד את הלבלב הדבוק.
   2. הכניסו את מקטע המעי ל-DPBS קר כקרח ללא Ca²⁺ או Mg²⁺ (איור 1A).
      הערה: ניתן להסיר גם מקטעים אחרים של המעי או המעי הגס באותה טכניקה.
4. השתמשו במזרק של 5 או 10 מ"ל המחובר למחט 20 גרם בקצה קהה כדי לשטוף את תוכן הצואה עם DPBS קר כקרח (איור 1B).
5. מחלקים את המעי למקטעים של 3 ס"מ כדי להסיר את השריר האורכי. הערה: מקטעי מעיים של עד שני עכברים משמשים לכל 30 מ"ל של תמיסת הבידוד HEPES/EDTA/DPBS.
6. שוברים כ-4 ס"מ כדי להפריד את מקל העץ מקצה הכותנה. השרו את מקל העץ ב-DPBS (איור 1C).
7. החליקו את אחד ממקטעי המעי בצורה חלקה על המקל הרטוב (איור 2A-C).
8. הסירו את המזנטרייה הדבקה שעדיין מחוברת באמצעות מלקחיים עם אף מחט (איור 2D).
9. השתמשו בסכין גילוח או אזמל נקיים כדי ליצור שני ניקים אורכיים לאורך המעי שבו המזנטריה הייתה מחוברת (איור 2E).
   1. הרטיבו את קצה הכותנה בעזרת DPBS. שפשפו את קצה הכותנה הרטוב לאורך השריר כדי לשחרר את השריר האורכי/מקלעת המעיים המינטרית (LMMP). לאחר מכן, הזיזו את קצה הכותנה אופקית כדי להרחיק את ה-LMMP מהשריר המעגלי לאורך מקטע המעי במהלך הסרת LMMP.
   2. החזיקו את קצה המקל בין האגודל לאצבע תוך ייצוב המקטע עם האצבע האמצעית והרביעית (איור 2F). בהשלמתו, LMMP יקלף בקלות את קטע המעי.
10. יש להשליך את ה-LMMP שהופשט מצינור המעי ומחובר לצמר גפן, אלא אם כן רוצים לקצור EGCs מהמקלעת המינטרית.
11. השתמש בסכין גילוח כדי לפתוח את קטע המעי לאורכו כדי להסיר אותו ממקל העץ.
12. אחסנו את רקמת המעי המופשטת (בעיקר רירית ותת-רירית בתוספת שריר מעגלי) ב-DPBS על קרח. חזור על שלבים 4.4-4.11 עד שכל מקטעי המעי מוכנים.

5. הסרת רירית האפיתל

1. חותכים את המעיים לחתיכות קטנות יותר של ~ 0.5 ס"מ עם מספריים עדינים.
2. מניחים את הרקמה בצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של תמיסת EDTA/HEPES/DPBS קרה כקרח.
3. רוק את התמיסה המכילה רקמות ב 4 ° C למשך 10 דקות ב ~ 60 הטיות לדקה.
4. יש להרטיב מראש פיפטת פלסטיק בנפח 5 מ"ל על ידי הרטבת חיץ EDTA/HEPES/DPBS פעם אחת, ולאחר מכן להשתמש בפיפטה הלחה מראש כדי לקלף את הרקמה ואת תרחיף החיץ למעלה ולמטה (טריטורציה) 20 פעמים כדי לעקור את רירית האפיתל.
5. אספו את הרקמה מהדגירה של EDTA על ידי מזיגת התערובת דרך מסננת תאי ניילון של 100 מיקרומטר. השליכו את הזרימה העכורה המלאה בריריות (איור 3).
6. הניחו את הרקמה שנשמרה במסננת לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי חדש בנפח 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של EDTA/HEPES/DPBS קר כקרח באמצעות מלקחיים-אף.
7. חזור על הדגירה של EDTA/HEPES/DPBS פעם שנייה על ידי נדנוד הרקמה ב 4 ° C במשך 10 דקות ב ~ 60 הטיות לדקה כדי להסיר רירית אפיתל נוספת.
8. יש להרטיב מראש פיפטה של 5 מ"ל עם החיץ ולאחר מכן להרטיב את תרחיף הרקמה למעלה ולמטה 20 פעמים כדי לעקור את התאים הריריים.
   הערה: הרקמה נוטה להידבק לחלק הפנימי של פיפטה ככל שיותר מהאפיתל מוסר.
9. אספו את הרקמה לאחר הדגירה השנייה על ידי יציקת התערובת דרך מסננת תאי ניילון בגודל 100 מיקרומטר והשליכו את הזרימה דרכה. הזרימה השנייה אמורה להיות פחות עכורה באופן ניכר מהראשונה (איור 3).
10. חזרו על דגירות EDTA של 10 דקות עד שהתמיסה כמעט ברורה (כ-3 עד 4 דגירות בהתאם לכמות הרקמה וליעילות הטרייטורציה) (איור 3).

6. אוסף תאי גליה אנטריים מהלמינה פרופריה והתת-רירית

1. מעבירים את הרקמה ממסננת הניילון לצינור צנטריפוגה חרוטי בנפח 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של תמיסת שחזור התאים המסחרית ומתנדנד למשך 25-30 דקות בטמפרטורה של 4°C.
2. יש לשלש בעדינות פי 10 כדי לנתק את תאי הגליה האנטריים מהלמינה פרופריה (lamina propria).
   1. מסננים דרך מסנן 40 מיקרומטר ואוספים את התסנין בצינור נקי של 50 מ"ל.
   2. שטפו את הרקמה על מסנן הניילון עם 1 מ"ל של DPBS.
   3. השליכו את הרקמה והעבירו את ~5-6 מ"ל של תסנין לצינור צנטריפוגה חרוטי נקי של 15 מ"ל.
   4. סובבו את התסנין במהירות של 2,000 x גרם בצנטריפוגת דלי מתנדנדת למשך 5 דקות ב-4°C.
3. השהה מחדש את הגלולה המכילה תאי גליה בלפחות 1 מ"ל של חיץ מתלה על ידי פיפט עדין מעלה ומטה עם קצה פיפטה 500 μL. הימנע מהצגת bubbles.
   הערה: התאם את נפח המתלים לפי הצורך למספר הבארות והצלחות. לדוגמה, 1.2 מ"ל עבור צלחת אחת של 6 בארות, 2.4 מ"ל עבור שתי צלחות של 6 בארות, 2.4 מ"ל עבור צלחת אחת של 12 בארות.
4. פיפטה 200 μL של תרחיף התא לתוך כל באר של 6-באר או 100 μL עבור לוחות מצופים PDL-laminin 12 באר המכילים מדיה גדילה גלייה.
5. אין להפריע לכלים לאחר הוספת התאים לצלחות והנחתם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למספר התאים המרבי להידבק.
   הערה: הכנה בריאה של תאים תתחבר תוך 6-8 שעות, אך חכו לפחות 24 שעות לפני שתשנו את המדיה על ידי פיפטציה עדינה של המדיה יחד עם תאים שאינם דבקים.
6. השתמשו בתאים לניסויים 3-4 ימים לאחר הכנסתם לתרבית (איור 4).

טבלה 1. הרכב אמצעי השעיה של תאי גלייה.

רכיבים	אמצעי אחסון שיש להוסיף	ריכוז סופי
DMEM/F12	44.5 מ"ל	_
סרום בקר עוברי (FBS)	5 מ"ל	10%
פניצילין-סטרפטומיצין	500 μL	עט 100 IU/מ"ל
סטרפטומיצין		100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפ
Gentamicin (50 מ"ג / מ"ל מלאי)	20 מיקרוליטר	20 מיקרוגרם/מ"ל

טבלה 2. הרכב מצע גדילת תאי גליה

רכיבים	אמצעי אחסון שיש להוסיף	ריכוז סופי
DMEM/F12	44 מ"ל	_
סרום בקר עוברי (FBS)	5 מ"ל	10%
פניצילין-סטרפטומיצין (100x)	500μL	100 IU/מ"ל (עט)
100 מיקרוגרם/מ"ל (Strep)
Gentamicin (50 מ"ג / מ"ל מלאי)	20 מיקרוליטר	20 מיקרוגרם/מ"ל
GDNF (מלאי של 10 מיקרוגרם/מ"ל)	50 מיקרוליטר	10 נ"ג/מ"ל

תוצאות

איור 1: הגדרה והכנה של מעיים של עכברים.(A) תמונה של בידוד שנוצר על קרח כולל מעיים שחולצו. (B) תמונה של מזרק 5 מ"ל המחובר למחט קצה קהה של 20 גרם כדי לשטוף את תכולת הצואה. (C) קצה מהונדס של צמר גפן מעץ (~4 ס"מ) ספוג במאגר DPBS.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פולי-D ליזין (1 מ"ג/מ"ל מלאי)	סיגמא	A-003-E	דילול 1:10
למינין (0.5 מ"ג/מ"ל מלאי)	סיגמא	L4544	לדלל ל-10 מיקרוגרם/מ"ל על ICE
EDTA (0.5 מ')	לונזה	51201	לדלל 1:100 ב- DPBS
HEPES (1 מטר)	קורנינג	36216004	לדלל 1:100 ב- DPBS
פתרון שחזור תאים	קורנינג	354253
חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS)	הייקלון	SH30028.02
DMEM/F-12	תרמו פישר סיינטיפיק	11320033
פניצילין-סטרפטומיצין (100X)	לייף טכנולוגיות	15140-122
Gentamicin (50mg / mL מלאי)	לייף טכנולוגיות	15750060
GDNF (מלאי של 10 מיקרוגרם)	סיגמא	SRP3200
L-גלוטמין (מלאי של 200 מיליון)	לייף טכנולוגיות	25030-081
מסננת סל רשת ניילון (100 מיקרומטר)	פישר סיינטיפיק	22363549
מסננת סל רשת ניילון (40 מיקרומטר)	פישר סיינטיפיק	22363547
Pipet סרולוגי חד פעמי 5 מ"ל	פישר סיינטיפיק	13-678-11ד
0.25% טריפסין-EDTA (1X)	לייף טכנולוגיות	25200-056

מלח