כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. טיהור נימי מוח חזיריים
- אספו 8-10 מוחות מחזירי בית בני 5-6 חודשים (למשל מבית מטבחיים סמוך) והעבירו אותם על קרח למעבדה. אנו ממליצים להתחיל את הליך הטיהור הבא תוך 2-3 שעות מסיום החיה.
- הניחו את המוחות בספסל זרימה סטרילי ושטפו אותם בעדינות עם 1 ליטר PBS בכוס המונחת על קרח.
- הסירו בזהירות את קרומי המוח ממוח אחד בכל פעם באמצעות מלקחיים עדינים והעבירו את המוח נטול קרומי המוח לכוס 1 ליטר אחרת עם PBS מונח על קרח. הארכת הזמן שנדרש עלולה לסבך את ההסרה. הזמן המשוער המשמש עבור כל מוח צריך להיות 10-15 דקות.
- בעזרת אזמל, גרדו חומר אפור ממוח אחד בכל פעם והעבירו את החומר המבודד לצלחות פטרי (8.8 ס"מ2) המכילות 20 מ"ל תערובת חומרי מזון DMEM F-12 (DMEM/F-12) שהונחה על קרח. בודדו כמה שיותר חומר אפור מבלי למשוך חומר לבן. עבור פיצול ראשוני, להעביר את החומר האפור דרך מזרק 50 מ"ל ללא מחט. המשיכו לכל המוחות ואגרו את החומר האפור שנאסף. הארכת הזמן שנדרש עלולה לסבך את ההסרה. הזמן המשוער המשמש עבור כל מוח צריך להיות 10-15 דקות.
- העבר את חומר החומר האפור המבודד לצינור המטחנה של הומוגנייזר רקמות ידני ביחס של 50/50 עם מדיה DMEM/F-12. הומוגניזציה של החומר על ידי ביצוע 8 משיכות למעלה ולמטה עם מזיק רופף, ואחריו 8 משיכות למעלה ולמטה עם מזיק הדוק. ממשיכים עד שכל החומר המבודד הומוגני, ואז מעבירים את ההומוגנט לבקבוק של 500 מ"ל ומדללים עם DMEM/F-12 לנפח כולל של כ-450 מ"ל.
- סנן את ההומוגנט באמצעות בקבוק 500 מ"ל עם פקק כחול עם מחזיק מסנן ורשת מסנן 140 מיקרומטר, ובודד נימים על ידי העברת הרקמה דרך המסנן. השתמש במסנן אחד לכל 50 מ"ל הומוגנט ושטוף כל מסנן עם DMEM/F-12 לאחר מכן.
- הניחו את הפילטרים המכילים נימים בצלחות פטרי עם תמיסת עיכול של טריפסין/EDTA (2.5% טריפסין, 0.1 ננומטר EDTA ב-PBS), collagenase CLS2 (2,000 U/mL) ו-DNase 1 (3,400 U/mL) ב-DMEM/F-12. יש להשתמש בצלחת פטרי אחת (8.8 ס"מ2, 20 מ"ל תמיסה) לכל 3 רשתות פילטר.
- הניחו את צלחות הפטרי בטמפרטורה של 37°C למשך שעה על שייקר אורביטלי במהירות 180 סל"ד או ערבבו אותן בעדינות כל 10 דקות. לאחר 1 שעה, לשטוף את נימים מן המסננים עם השעיה מן צלחת פטרי באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
- פצלו את המתלים מ-3 הכלים ל-2 צינורות של 50 מ"ל ועצרו את העיכול על ידי הוספת 10 מ"ל DMEM/F-12 לכל צינור של 50 מ"ל.
- צנטריפוגות את מתלי התא ב 250 x גרם, 4 ° C למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנטים והשהו מחדש כל כדור ב 10 מ"ל של DMEM/F-12. הוסף 20 מ"ל נוספים של DMEM/F12 לכל צינור. חזור על שלב צנטריפוגה זה פעמיים.
- תנו לצינורות להתקרר על קרח למשך 5 דקות והעבירו את התמיסות לשני צינורות חדשים של 50 מ"ל.
- צנטריפוגו את מתלי התא ב 250 x גרם, 4 ° C למשך 5 דקות, והשהו מחדש כל כדור ב 8 - 10 מ"ל (כ 1 מ"ל / מוח בשימוש) של תמיסת הקפאה המורכבת מ 10% DMSO ב FBS.
- העבר את השעיית התא לקריוביאלים, באמצעות 1 מ"ל לכל קריוביאלי. בממוצע, טיהור גורם לבקבוקון אחד לכל מוח בשימוש, בממוצע מספק תאי אנדותל עבור 12-16 תוספות. הניחו את הבקבוקונים בקופסת הקפאה בטמפרטורה של -80°C למשך 4 שעות לפחות עד לילה. לאחר מכן, לאחסן את cryovials ב cryotank עם חנקן נוזלי.
זהירות: לחנקן נוזלי יש טמפרטורות נמוכות ביותר. אנא לבשו הגנה מתאימה.