כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון. הזרימה הפרוצדורלית של הפרוטוקול מתוארת באיור 1.
1. הגדרה עבור ההליך
- הכינו את מאגר כלי הדם במוח (BMB). התחילו במשקל 54.66 גרם D-מניטול, 1.90 גרם EGTA (אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילתר)-N,N,N′,N′,N′-חומצה טטראצטית), ו-1.46 גרם בסיס 2-אמינו-2-(הידרוקסימתיל)-1,3-פרופנדיול (כלומר, טריס) לתוך כד נקי. מוסיפים 1.0 ליטר מים נטולי יונים. ערבבו את רכיבי מאגר BMB באמצעות מערבל מגנטי. לאחר ערבוב יסודי של התמיסה יש להתאים את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1.0 M HCl.
- הכינו תמיסת דקסטרן 26% (MW 75,000) (w/v) לפני הרדמת בעלי חיים. בצע את השלבים הבאים כדי להכין את הפתרון dextran.
הערה: חשוב מאוד להכין את התמיסה הזו מראש, כי דקסטרן יכול לקחת בערך 1.5-2 שעות להתמוסס בחיץ מימי.
- שקלו את אבקת הדקסטרן (26 גרם ל-100 מ"ל) לתוך נקייה.
- מדדו את הנפח המתאים של BMB וחלקו אותו לכד נפרד ונקי.
- מוזגים באיטיות BMB לתוך הכד המכיל אבקת דקסטרן. במהלך המזיגה של BMB, ערבבו ידנית את אבקת הדקסטרן באמצעות מוט ערבוב זכוכית.
- כוונן את רמת החומציות ל-7.4 עם 1.0 M HCl מיד לפני השימוש.
הערה: בידוד טיפוסי של מיקרו-כלי דם במוח מ-12 חולדות Sprague-Dawley (זכר או נקבה; גיל 3 חודשים; 200-250 גרם כל אחת) דורש 200 מ"ל של תמיסת דקסטרן (כלומר, 52 גרם דקסטרן ב-200 מ"ל BMB).
2. מיצוי רקמת מוח מחולדות ספראג-דולי
- לאחר הטיפול הניסיוני הרצוי, מרדימים חולדות Sprague-Dawley באמצעות קטמין (50 מ"ג/ק"ג; 2.5 מ"ל/ק"ג i.p.) וקסילזין (10 מ"ג/מ"ל; 2.5 מ"ל/ק"ג I,p). לדלל קטמין וקסילזין במי מלח של 0.9% עד לריכוזים סופיים של 20 מ"ג/מ"ל ו-4.0 מ"ג/מ"ל, בהתאמה. יש להרדים בעלי חיים על ידי עריפת ראשים באמצעות גיליוטינה מושחזת בהתאם להנחיות IACUC (הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים). השתמש באותו הליך עבור חולדות Sprague-Dawley זכר ונקבה.
- כנסו את העור מגולגולת החולדה על ידי ביצוע חתך רוחבי יחיד באמצעות מספריים כירורגיים.
- באמצעות rongeur, בזהירות להסיר את צלחת הגולגולת ולחשוף את המוח.
- הסר את המוח באמצעות מרית. נתקו את המוח והכניסו את רקמת המוח המבודדת לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל BMB. יש להוסיף 1.0 מיקרוליטר קוקטייל מעכב פרוטאז לכל 1.0 מ"ל של חיץ BMB מיד לפני השימוש.
3. עיבוד מוחי
- העבר את רקמת המוח מצינור החרוט 50 מ"ל לצלחת פטרי נקייה.
- בעזרת מלקחיים, גלגלו בעדינות את המוח על נייר סינון בקוטר 12.5 ס"מ כדי להסיר את קרומי המוח החיצוניים, אשר דבוקים באופן רופף לקליפת המוח. לחץ בעדינות על רקמת המוח כנגד נייר סינון וגלגל את הרקמה שוב. סובב את נייר הסינון לעתים קרובות במהלך שלב זה.
- להפריד את מקלעת כורואיד מן ההמיספרות המוחיות באמצעות מלקחיים.
הערה: מקלעת הכורואיד מופיעה כרקמה קרום שקופה הממוקמת על פני השטח של חדרי המוח.
- שטח בעדינות את רקמת המוח והסר את קרומי המוח הנותרים ונורות הריח באמצעות מלקחיים.
- הניחו את רקמת המוח בקליפת המוח במכתש זכוכית צונן. הוסף 5.0 מ"ל של קוקטייל מעכב פרוטאז BMB למכתש.
- באמצעות הומוגנייזר כוח עילי, הומוגניזציה של רקמת המוח באמצעות 15 משיכות למעלה ולמטה ב -3,700 סל"ד. בצע הומוגניזציה באמצעות מרגמה 10 מ"ל ומטחנת רקמות מזיקים. בין הומוגניזציה של כל דגימה בודדת, לנקות את pestle באמצעות 70% אתנול.
הערה: שבץ הומוגניזציה צריך להיות עקבי במונחים של קצב וגודל.
- יוצקים את ההומוגנט לצינורות צנטריפוגות מסומנים.
4. שלבי צנטריפוגה
- הוסף 8.0 מ"ל של 26% תמיסת דקסטרן לכל צינור צנטריפוגה מסומן המכיל הומוגנט במוח.
- הפוך את הצינור פעמיים ולאחר מכן מערבל היטב את הדגימה. בצע את המערבולת של כל דגימה באמצעות זוויות מרובות כדי להבטיח ערבוב יסודי של תמיסה הומוגנית במוח עם תמיסת דקסטרן 26%.
- דגימות צנטריפוגות בטמפרטורה של 5,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4°C.
הערה: עבור ניתוחים מסוימים, כדאי להשוות microvessels המוח עם parenchyma המוח. אם תידרש הערכה של ביטוי חלבונים בפרנכימה במוח, ניתן לאסוף את הסופרנאטנט משלב צנטריפוגה זה (כלומר, מקטע פרנכימלי במוח) ולאחסן אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
- מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת שואב ואקום ופיפטה פסטר מזכוכית.
הערה: יש להיזהר שלא להפריע לכדור. אחרת, כמות microvessels המוח שנאספו יופחת, אשר יקטין באופן משמעותי את תשואת החלבון מהליך זה.
- יש להשהות מחדש את הגלולה ב-5.0 מ"ל של קוקטייל מעכב פרוטאז המכיל BMB (כלומר, קוקטייל מעכב פרוטאז 1.0 מיקרוליטר לכל 1.0 מ"ל של מאגר BMB). מערבבים את הגלולה כדי להבטיח ערבוב יסודי.
- הוסף 8.0 מ"ל של 26% דקסטרן לכל צינור צנטריפוגה ומערבולת כמתואר בשלבים 4.1-4.2 של פרוטוקול זה.
- דגימות צנטריפוגות בטמפרטורה של 5,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4°C.
- באמצעות בקבוק ואקום ופיפטה זכוכית, שואפים supernatant ולוודא כי הגלולה המכילה את microvessel המוח אינו משובש.
הערה: חומר עודף שנדבק לדופן הצינור אינו מכיל מיקרו-כלים ויש לנקות ולהסיר אותו בזהירות.
- חזור על שלבים 4.5 עד 4.8 פעמיים נוספות.
- לאחר השלמת 4 שלבי צנטריפוגה דקסטרן, הוסף 5.0 מ"ל BMB לכל גלולה ומערבולת כדי להשעות מחדש את הדגימה.
הערה: לאחר השלמת שלב 4.10, ניתן לאסוף מיקרו-כלים שלמים לניתוח לוקליזציה של חלבונים. ניתן להשיג זאת על ידי לקיחת אליציטוט של 50 μL של גלולת מיקרו-כלי תלויה מחדש ומריחה על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית. לאחר מכן הכלים הזעירים קבועים בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על בלוק חימום, ולאחר מכן קיבוע באתנול קר כקרח למשך 10 דקות נוספות. לאחר מכן ניתן לאחסן שקופיות בטמפרטורה של 4°C עד שיידרש למחקרי הדמיה.
