יצירת נוירונים פירמידליים קורטיקליים מתאי גזע עצביים אנושיים

תקציר

מקור: Gouder, L., et al,. כימות תלת-ממדי של קוצים דנדריטיים מנוירונים פירמידליים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מתאר שיטה להכנת כיסויי זכוכית המצופים בפוליאורניתין ולמינין כדי לשפר את ההידבקות והצמיחה של תאי גזע עצביים. הטכניקה כוללת דגירות רציפות ושטיפות, מה שמקל על היווצרות מטריצה תומכת המקדמת צמיחה והתמיינות של תאים עצביים, המחקה מבנים הנמצאים בנוירונים.

פרוטוקול

1. תרבות עצבית
   הערה: תכנות מחדש של פיברובלסטים בתאי גזע פלוריפוטנטים, מחויבות לשושלת הטלנספלון הגבי, גזירה והגברה של אבות קליפת המוח המאוחרת (LCP) תוארו ב-Boissart et al. התמיינות עצבית של תאים דמויי LCP בוצעה גם על פי Boissart et al עם שינויים קלים. נהלים אחרים פותחו לתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, ולאחר מכן התמיינותם לנוירונים. פרוטוקול זה נשמר מכיוון שהוא מאפשר ייצור סלקטיבי של נוירונים גלוטמטרגיים פירמידליים.
   1. יש לטפל בצלחות תרבית 6 בארות עם כיסויי זכוכית עם פולי-אורניתין (מדולל ל-1/6 ב-DPBS (Dulbecco s Phosphate Buffered Saline), ריכוז מלאי 0.01%) O/N, ולאחר מכן שלוש שטיפות ב-DPBS. לאחר מכן יש להוסיף למינין (ריכוז מלאי 1 מ"ג/מ"ל, מדולל 500 פעמים ב-DPBS) למשך 10 שעות לפחות מתחת למכסה המנוע.
   2. צלחת ושיגור NSC בצפיפות נמוכה (50,000 תאים/ס"מ²) בצלחות תרבית 6 בארות עם כיסויי זכוכית ב-3 מ"ל של מדיום תרבית המורכב מ-DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)/F12 (500 מ"ל), 2 בקבוקונים (5 מ"ל כל אחד) של תוסף N2, 2 בקבוקונים (10 מ"ל כל אחד) של תוסף B27, 10 מ"ל פן-סטרפטומיצין (פניצילין = 10,000 יחידות/מ"ל וסטרפטומיצין = 10,000 יחידות/מ"ל), 1 מ"ל של 2-מרקפטואתנול (תמיסת מלאי: 50 mM) ולמינין (1/500), ללא גורמי גדילה. שלב קריטי: בצע שלב זה בזהירות על-ידי הוספת תאים עם תנועות סיבוב איטיות כדי להפחית את קיבוץ התאים.
   3. הסר את מדיום התרבות. הוסף מדיום N2B27 טרי המכיל 2 מיקרוגרם/מ"ל של תמיסת למינין טרייה כדי לשמור על תא העצב מחובר לכיסויי הזכוכית ולמנוע היווצרות גושים. שנה את המדיום כל 3 ימים. שמור חלק מהתווך הנותר (200 מיקרוליטר) לפני הוספת מדיום טרי כדי למנוע מהתא להתייבש. לחלופין, המשך במהירות ושנה את הנפח הכולל (3 מ"ל).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
PD-PBS (1X), ללא סידן, מגנזיום ופנול אדום	Gibco/ Life Technologies	14190169
פולי-L-אורניתין תמיסה ביוריאגנטית	סיגמא אולדריץ'	עמ' 4957
למינין עכבר	Dutscher דומיניק	354232
תוספת N2	Gibco/ Life Technologies	17502048
תוסף B-27 עם ויטמין A (50X)	Gibco/ Life Technologies	12587010
DMEM/NUT. מיקס F-12 עם GLUT-I	Gibco/ Life Technologies	31331028
נוירובזל מד SFM	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-מרקפטואתנול	Gibco/ Life Technologies	31350-010
עט-סטפטומיצין	Gibco/ Life Technologies	15140-122
זכוכית כיסוי 13 מ"מ	VWR	631-0150
מגיב אנטי-דהייה זהב ממושך avec DAPI	Gibco/ Life Technologies	P36931
Tween(R) 20 Bioextra, נוזל צמיג	סיגמא אולדריץ' צ'ימי	P7949
פיברובלסטים אנושיים	מאגר ביולוגי של קו תאי Coriell	GM 4603 ו-GM 1869	מכון קוריאל למחקר רפואי, קמדן, ניו ג'רזי, ארה"ב
אינקובטור CO2
6 צלחות תרבות באר
פיפט