כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנה והסרה של המוח מהעכבר לחיתוך
- מתכוננים לזילוח ולדגירה של פרוסות.
- כ-30 דקות לפני החיתוך, הכינו תמיסת חיתוך עתירת סוכרוז ונוזל מוחי מלאכותי דל סידן (aCSF) לדגירת הפרוסה לפני ההקלטה או ההדמיה.
- הניחו את כל הכלים הדרושים (מספריים גדולים קהים, מספריים קפיציים קטנים, מלקחיים אנטומיים, מספריים גדולים או גיליוטינה, מספריים קשתית, מלקחיים תכשיטנים, מזרק 10 מ"ל עם מחט 27G x 1/2 אינץ ', חתיכה קטנה של נייר סינון בגודל 1 ס"מ x 2 ס"מ, ופיפטה פסטר שבורה להעברת פרוסות) לזילוח וחיתוך, והכינו מגש זילוח.
- הקמת תא דגירה עם aCSF מחומצן באמבט מים של 32 מעלותצלזיוס ותבשיל תרבית מלא בתמיסת חיתוך.
- מכינים את שלב החיתוך לחיתוך.
- חתכו חתיכה קטנה של 3% אגר בערך 1 ס"מ3 לשימוש כמעצור אחורי למוח ו 1.5 ס"מ x 1.5 מ"מ x 3 מ"מ עבור בליטה שתשמש לתמיכה בקולקולוס התחתון (IC).
- הדביקו את הבק-סטופ על הבמה עם דבק ציאנואקרילט וכן את הבליטה בצד ימין של הבק-סטופ כך שהם יוצרים זווית של 80מעלות.
- הסר את המוח.
- הרדמה עמוקה של עכבר לאחר הלידה 12 - יום 20 לאחר הלידה (p12-p20, רצוי p14-18) עכבר עם קטמין 100 מ"ג / ק"ג וקסילקסין 3 מ"ג / ק"ג (או הליך דומה שאושר על ידי ועדת האתיקה).
הערה: יש לוודא רמת הרדמה תקינה באמצעות חוסר תגובה לצביטת הבוהן. מכיוון שהחיה נמצאת תחת הרדמה קצרה, משחה אופתלמית מיותרת.
- בעזרת מספריים קהות, חושפים את כלוב הצלעות מתהליך הקסיפואיד לצוואר.
- מצא את תהליך xiphoid, ולעשות חתך אופקי של כ 1.5 ס"מ.
- בצע שני חתכים אנכיים מקצות החתך האופקי הקודם לכתפיים, כ -1.5 ס"מ כל אחד.
- חותכים דרך הסרעפת ואת הצמתים costochondral כדי לחשוף את הלב.
- בעזרת מספריים קפיציים קטנים, יוצרים חתך קטן, 2-5 מ"מ באטריום הימני, מהצד הגחוני לצד הגבי של הלב.
- באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 27G x 1/2 אינץ ', להזריק את החדר השמאלי במהירות לחורר את החיה עם תמיסת חיתוך סוכרוז גבוהה.
- ברגע שהדם נוזל צלול, השתמש במספריים גדולים יותר כדי להסיר את הראש.
הערה: לא הערכנו באופן שיטתי את התועלת של זילוח. עם זאת, מניסיוננו, זילוח לב בעכברים צעירים כל כך יכול להיעשות עם כמעט 100% הצלחה, ויש לו את היתרון של חיסול כדוריות דם אדומות, אשר יכול פלואורס ולהפריע הדמיה.
- חתכו את העור לאורך קו האמצע כדי לחשוף את הגולגולת.
- בעזרת מספריים קשתית כפופה, חותכים את הגולגולת בין העיניים, ואז מתחילים מהחתך בין העיניים, חותכים בזהירות מהקדמי לאחורי לאורך תפר קו האמצע תוך הקפדה שלא לפגוע במוח שמתחת.
הערה: הדורה בדרך כלל יורדת עם הגולגולת. במידת הצורך, להסיר את dura לפני בזהירות להסיר את המוח.
- בעזרת מלקחיים של תכשיטנים, לפתוח את הגולגולת ולהסיר בזהירות את המוח, ואז להניח את המוח בתמיסת חיתוך. יש להקפיד להימנע מפגיעה בקליפת המוח.
2. הכנת המוח לחיתוך
- הכנת המוח להרכבה על במת הוויברטום.
- באמצעות שקופית המסומנת בשני קווים ב 90o וקו אלכסוני ב 17o משמאל למעלה לימין למטה, מצטלב במקום שבו שני הקווים נפגשים, מניחים את הצד הגבי של המוח כלפי מעלה, באמצעות סכין גילוח, להסיר 2-4 מ"מ של המוח קצה רוסטרלי יצירת משטח שטוח.
- הניחו את הצד הקאודלי של המוח על המשטח השטוח שזה עתה נוצר, ויישרו את פני השטח הגביים של המוח עם קו האמצע האופקי ואת קו האמצע של המוח עם הקו האנכי.
- יישרו את סכין הגילוח עם קו 17o, הטו את סכין הגילוח בזווית של 30o והסירו כ-3 מ"מ מקליפת המוח הימנית בחיתוך אלכסוני כפול (17o מהמישור האופקי ו-60o מהעטרה).
- הרכבת המוח על במת הוויברטום.
- הניחו פיסת נייר סינון קטנה בגודל 1X2 ס"מ בצד הגחוני של המוח, כך שהממד הארוך יהיה מאונך לקו האמצע.
- יש למרוח בזהירות כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט על האזור שלפני המעצור האחורי (ומשמאל לבליטה).
- הניחו את פני המוח החתוכים באלכסון כפול על הדבק כך שהחלק הקאודלי של המוח והמוח האחורי יישען על הגבשושית והצד הימני של המוח יהיה כנגד ה-backstop.
- לחץ בעדינות על המוח, וודא שכל פני השטח נמצאים במגע עם תא החיתוך.
3. השגת פרוסת קוליקולו-תלמוקורטיקלית
- במהירות לקחת את שלב חיתוך ומניחים את הוויברטום, למלא את הבמה עם פתרון חיתוך.
- יישרו את הלהב עם החלק העליון (הצד הגחוני) של המוח.
- הסר 1-1.5 מ"מ מהחלק העליון של המוח, הסר פרוסות 300-500 מיקרומטר והערך עומק לאחר ההסרה.
הערה: כאשר IC, גוף הגניקולאט המדיאלי (MGB), וגרעין הגניקולאט הצידי (LGN) נראים כולם, והפיתול המשונן יוצר צורת 'C' קח פרוסה אחת עד שתיים של 600 מיקרומטר. ראו איור 1A.
- מניחים פרוסות בתא אחיזה מחומם (32 מעלותצלזיוס).
