מאמר שיטה

אינדוקציה חוץ גופית של צמתים עצביים-שריריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מהונדסים המושרים על ידי בני אדם

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור:Lin, C. et al., In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Cells . J. Vis. Exp.(2020).

ניסוי זה מפרט שיטה ליצירת צמתים עצביים-שריריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. הוא משתמש בתהליך התמיינות מדורג כדי לקדם התפתחות נוירונים מוטוריים ונוירונים מוטוריים ויצירת סינפסות, ומניב צמתים עצביים-שריריים תפקודיים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת לוחות מצופים מטריצה חוץ-תאית (ECM)

  1. לדלל ECM (ראה טבלת חומרים) עם 1x PBS קר כקרח לריכוז סופי של 2%
  2. הוסף 1 מ"ל של ECM ל 49 מ"ל של 1x PBS בצינור פלסטיק של 50 מ"ל. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים.
  3. מניחים 1 מכסה לתוך כל באר של צלחת 6 בארות. הוסף 1.5 מ"ל של 2% ECM לכל באר.
  4. לדגור את צלחת הבאר עם ECM 2% במשך 2 שעות ב 37 ° C.
  5. יש לשאוף ECM מצלחת הבאר ולאחסן את הצלחת בטמפרטורה של 4°C לפני השימוש.

2. הבחנה של iPSCs לכיוון NMJ

  1. זרע 4 x 105 של iPSCs לכל באר על צלחת 6 באר מוכן בסעיף 1. יש להקפיד לזרוע את התאים על הכיסוי, שהופקדו מראש בבאר.
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש בקו התאים 201B7MYOD iPS.
    1. הסר את המדיום מתאי ה- iPSC על צלחת התרבית בקוטר 6 ס"מ ושטוף את ה- iPSCs פעם אחת עם PBS אחד.
    2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לצלחת ודגר במשך 10 דקות ב 37 ° C.
    3. מוסיפים 3 מ"ל של תאי גזע עובריים פרימטים (ES) לצלחת ופיפטה עדינה 3 פעמים.
    4. אספו את הסופרנטנט, המכיל iPSCs מנותקים, לתוך צינור פלסטיק של 50 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 160 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות.
    5. בזהירות לשאוף את supernatant, להשעות מחדש את iPSCs ב 3 מ"ל פרימאט ES תא בינוני עם 10 μM Y27632, ולספור את מספר התא באמצעות hemocytometer.
    6. לדלל את iPSCs עם פרימאט ES cell medium ו 10 μM Y27632 לריכוז של 2 x 105 תאים/מ"ל. הוסף 2 מ"ל של iPSCs על תלוש הכיסוי שהופקד מראש בבאר המתוארת בסעיף 1.

3. אינדוקציה של iPSCs ל- NMJ

  1. ביום 1, 24 שעות לאחר זריעת iPSCs לצלחת 6 בארות, להסיר את מדיום התרבית ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של פרימאט טרי ES תאים תווך המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין לכל באר.
  2. שנה את התווך עם 2 מ"ל של מדיום התמיינות מיוגני (MDM) (טבלה 1) המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין (ריכוז סופי) לכל באר. רענן את המדיום כל יום מיום 2 עד יום 10.
  3. מהיום ה-11, העבר את המדיום ל-2 מ"ל של מדיום NMJ (טבלה 1) לכל באר. יש לרענן את המדיום כל 3\u20124 ימים לאחר מכן עד ליום ה-30.
  4. שימו לב למיקרוסקופ ההפוך המובחן NMJ על ידי פאזה ביום ה-30. NMJ יכול לשמש לניתוח הבא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טבלה 1: נוסחה של מדיום.

...
מדיום התמיינות מיוגני (MDM)MEM-אלפא500 מ"ל
100mM 2-ME1117μL
דוקסיציקלין1מיקרוגרם/מ"ל
KSR56 מ"ל (סופי עד 10%)
עט/סטרפ

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בינוני, גורמי גדילה וריאגנטים
2-מרקפטואתנולNacalai tesque21418-42
B27, גיבקוגיבקו12587-001
BDNFמערכות מו"פ248-BD
פתרון ניתוק תאים, Accumaxטכנולוגיות STEMCELL#07921
מייבש כביסה נקודתי קריטיהיטאצ'יES-2030
דוקסיציקליןטאקרה631311
ECM, מטריג'ל (גורם גדילה מופחת)קורנינג356230
GDNFמערכות מו"פ212-תמ"ג
Gelation, ג'ל IPצוות ג'נוPG20-1
מעיל יוניםג'אולJEC3000FC
iPSC בינוני, mTeSRטכנולוגיות STEMCELL85850
נוקאאוט SR (KSR)גיבקו10828-028
מיקרוסקופ תאים חייםניקוןמיקרוסקופ Eclipse Ti
MEM-אלפאגיבקו12571-071
N2, Gibcoגיבקו17502-048
מדיום נוירובזאליגיבקו21103-049
NT3מערכות מו"פ267-N3
פרימאט ES תא בינוניReproCellRCHEMD001
SEMהיטאצ'יS-4700
TEMהיטאצ'יH7650
Y27632Wako כימיקלים GmbH253-00513

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Human iPSCsMYOD InductionMyotube FormationMotor Neuron DifferentiationNeuromuscular JunctionDoxycycline TreatmentROCK InhibitorECM CoatingCell DifferentiationSynapse Formation

מאמרים קשורים