מאמר שיטה

אינדוקציה חוץ גופית של צמתים עצביים-שריריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מהונדסים המושרים על ידי בני אדם

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור:Lin, C. et al., In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Cells . J. Vis. Exp.(2020).

ניסוי זה מפרט שיטה ליצירת צמתים עצביים-שריריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. הוא משתמש בתהליך התמיינות מדורג כדי לקדם התפתחות נוירונים מוטוריים ונוירונים מוטוריים ויצירת סינפסות, ומניב צמתים עצביים-שריריים תפקודיים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת לוחות מצופים מטריצה חוץ-תאית (ECM)

  1. לדלל ECM (ראה טבלת חומרים) עם 1x PBS קר כקרח לריכוז סופי של 2%
  2. הוסף 1 מ"ל של ECM ל 49 מ"ל של 1x PBS בצינור פלסטיק של 50 מ"ל. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים.
  3. מניחים 1 מכסה לתוך כל באר של צלחת 6 בארות. הוסף 1.5 מ"ל של 2% ECM לכל באר.
  4. לדגור את צלחת הבאר עם ECM 2% במשך 2 שעות ב 37 ° C.
  5. יש לשאוף ECM מצלחת הבאר ולאחסן את הצלחת בטמפרטורה של 4°C לפני השימוש.

2. הבחנה של iPSCs לכיוון NMJ

  1. זרע 4 x 105 של iPSCs לכל באר על צלחת 6 באר מוכן בסעיף 1. יש להקפיד לזרוע את התאים על הכיסוי, שהופקדו מראש בבאר.
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש בקו התאים 201B7MYOD iPS.
    1. הסר את המדיום מתאי ה- iPSC על צלחת התרבית בקוטר 6 ס"מ ושטוף את ה- iPSCs פעם אחת עם PBS אחד.
    2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לצלחת ודגר במשך 10 דקות ב 37 ° C.
    3. מוסיפים 3 מ"ל של תאי גזע עובריים פרימטים (ES) לצלחת ופיפטה עדינה 3 פעמים.
    4. אספו את הסופרנטנט, המכיל iPSCs מנותקים, לתוך צינור פלסטיק של 50 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 160 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות.
    5. בזהירות לשאוף את supernatant, להשעות מחדש את iPSCs ב 3 מ"ל פרימאט ES תא בינוני עם 10 μM Y27632, ולספור את מספר התא באמצעות hemocytometer.
    6. לדלל את iPSCs עם פרימאט ES cell medium ו 10 μM Y27632 לריכוז של 2 x 105 תאים/מ"ל. הוסף 2 מ"ל של iPSCs על תלוש הכיסוי שהופקד מראש בבאר המתוארת בסעיף 1.

3. אינדוקציה של iPSCs ל- NMJ

  1. ביום 1, 24 שעות לאחר זריעת iPSCs לצלחת 6 בארות, להסיר את מדיום התרבית ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של פרימאט טרי ES תאים תווך המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין לכל באר.
  2. שנה את התווך עם 2 מ"ל של מדיום התמיינות מיוגני (MDM) (טבלה 1) המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין (ריכוז סופי) לכל באר. רענן את המדיום כל יום מיום 2 עד יום 10.
  3. מהיום ה-11, העבר את המדיום ל-2 מ"ל של מדיום NMJ (טבלה 1) לכל באר. יש לרענן את המדיום כל 3\u20124 ימים לאחר מכן עד ליום ה-30.
  4. שימו לב למיקרוסקופ ההפוך המובחן NMJ על ידי פאזה ביום ה-30. NMJ יכול לשמש לניתוח הבא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טבלה 1: נוסחה של מדיום.

...
מדיום התמיינות מיוגני (MDM)MEM-אלפא500 מ"ל
100mM 2-ME1117μL
דוקסיציקלין1מיקרוגרם/מ"ל
KSR56 מ"ל (סופי עד 10%)
עט/סטרפ

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בינוני, גורמי גדילה וריאגנטים
2-מרקפטואתנולNacalai tesque21418-42
B27, גיבקוגיבקו12587-001
BDNFמערכות מו"פ248-BD
פתרון ניתוק תאים, Accumaxטכנולוגיות STEMCELL#07921
מייבש כביסה נקודתי קריטיהיטאצ'יES-2030
דוקסיציקליןטאקרה631311
ECM, מטריג'ל (גורם גדילה מופחת)קורנינג356230
GDNFמערכות מו"פ212-תמ"ג
Gelation, ג'ל IPצוות ג'נוPG20-1
מעיל יוניםג'אולJEC3000FC
iPSC בינוני, mTeSRטכנולוגיות STEMCELL85850
נוקאאוט SR (KSR)גיבקו10828-028
מיקרוסקופ תאים חייםניקוןמיקרוסקופ Eclipse Ti
MEM-אלפאגיבקו12571-071
N2, Gibcoגיבקו17502-048
מדיום נוירובזאליגיבקו21103-049
NT3מערכות מו"פ267-N3
פרימאט ES תא בינוניReproCellRCHEMD001
SEMהיטאצ'יS-4700
TEMהיטאצ'יH7650
Y27632Wako כימיקלים GmbH253-00513

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

iPSCMYODROCKECM

מאמרים קשורים