כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. מערך ניסיוני
- לפני תחילת קצירת רקמות ותאים, בדקו שכל הכלים סטריליים. במידת הצורך, רכבו זוג מספריים כירורגיים חדים, זוג מלקחיים עדינים מאוד וזוג מלקחיים סטנדרטיים עדינים. כמו כן, בהתאם לצורך, יש לעקר כל מצע לפני זריעת התאים באמצעות עיקור UV, חשיפה לאתנול או עיקור בקיטור.
- הכנת פתרונות מדיה ומלאי לקצירת נוירונים ודיסוציאציה
- הכינו את המדיום של בוטנשטיין וסאטו (BS), על ידי הוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין (PS) ותוסף N2 1% למדיום F12 של Ham. חשב את הנפח הסופי הדרוש כ 500 μl לכל באר (אם באמצעות צלחת 24 באר).
- הכינו מלאי collagenase IV בתווך F12 של Ham בריכוז של 1.25% wt/v. סננו את התמיסה ואחסנו בטמפרטורה של -20°C כ-200 μl aliquots.
- הכינו מלאי טריפסין של לבלב בקר בתווך F12 של Ham בריכוז של 2.5% wt/v, סננו ועיקרו ואחסנו ב -20 °C כמו 200 μl aliquots.
- הכינו את תמיסת המלאי של גורם גדילה עצבי (NGF) בריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל בתמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) מעוקר במסנן 1 מ"ג/מ"ל ללא חומצות שומן (BSA) במדיום F12 ואחסנו בטמפרטורה של -20°C כאליציטוטים של 200 μl. אין לסנן את ה-NGF לאחר ההרכבה מחדש.
- במקרה שלא בוצע שינוי בפני השטח, יש לכסות את המעיל/צלחות עם פולי-D-ליזין (0.1 מ"ג/מ"ל למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר [RT]) ו/או למינין (2-10 מיקרוגרם/ס"מ2 למשך שעתיים ב-37°C) לתמיכה בחיבור נוירונים ובצמיחת נוירונים בהתאם לצורך.
- יש לחמם תמיד את המדיה באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
2. קציר ודיסוציאציה של נוירונים מסוג גרעיני שורש גבי (DRG)
- לסיים את החולדה על ידי נקע צוואר הרחם ועריפת ראש. גלחו את החולדה והרימו את העור כדי לחשוף את עמוד השדרה. באמצעות מספריים חדים, הבלו עמוד השדרה תוך טיפול נוסף באיברים וכלי הדם הכלואים. מעבירים את עמוד השדרה בארון בטיחות ביולוגי (Class II) באמצעות צלחת פטרי ומסירים כל חלק גבי.
- חלקו את עמוד השדרה לשניים לאורך ציר האורך באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים וחדים כדי לחשוף את רקמת חבל הטבור. בשלב זה, מועיל לחתוך את עמוד השדרה בשני מקטעים קטנים יותר מתחת לגובה כלוב הצלעות, כדי להקל על הטיפול במהלך קציר נוירוני DRG. באמצעות מלקחיים עדינים, להסיר בעדינות את כל רקמת הטבור, לשים לב לא למשוך ולהסיר את שורשי DRG. בדרך זו ה-DRG והשורשים ייחשפו בתוך תעלות החוליות, שעדיין עטופות בטור. התבוננו ב-DRG כחוטים לבנים היוצאים ישירות מהתעלות.
- הוציאו את כל שורש ה-DRG (לא רק את ה-DRG) מתעלות החוליות על ידי שימוש במלקחיים עדינים מאוד, כניסה לעומק תעלות החוליות ותשומת לב שלא לפגוע בשורשי הגרעינים. מעבירים את ה-DRG לצלחת פטרי קטנה (60 מ"מ2) המכילה 3-4 מ"ל של מדיום F12 של Ham's בתוספת 1% PS. אם אתם משתמשים בבעלי חיים שונים, השתמשו בכלים נפרדים.
- תחת מיקרוסקופ מנתח, נקו את ה-DRG מכל עודף של שורשי עצבים המקיפים את הגרעינים באמצעות מלקחיים סטריליים ואזמל כדי להפחית את זיהום תאי הגלייה. מעבירים את ה-DRG לצלחת פטרי קטנה (35 מ"מ2) עם 1.8 מ"ל של מדיום F12 טרי.
- הוסף 200 μl של 1.25% wt/v collagenase סוג IV תמיסת מלאי (ריכוז סופי של 0.125%) ודגר את DRG ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 1 שעה. בזהירות לשאוף את המדיום עם פיפטה זכוכית, לשים לב לא לשאוף או לפגוע DRG. יש להוסיף F12 בינוני טרי בתוספת אנזים 0.125% wt/v collagenase type IV ולדגור במשך שעה אחת כפי שתואר קודם לכן.
- שאפו את המדיום ושטפו בעדינות את ה-DRG עם מדיום F12. לאחר מכן להוסיף 1.8 מ"ל של F12 בינוני ו 200 μl של טריפסין (ריכוז סופי של 0.25% wt/v) ולדגור ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 30 דקות.
- הסר טריפסין והוסף 1 מ"ל של מדיום F12 בתוספת 500 μl של סרום בקר עוברי (FBS) כדי לעצור את התגובה האנזימטית. שאפו את המדיום ושטפו בעדינות את ה-DRG עם מדיום F12 במשך שלוש פעמים כדי להסיר עקבות של סרום.
- מוסיפים 2 מ"ל של מדיום F12 טרי ומעבירים בזהירות את ה-DRG עם המדיום לצינור של 15 מ"ל באמצעות פיפטה מזכוכית. נתקו בעדינות את תאי העצב של DRG על ידי פיפטציה למעלה ולמטה (בערך 8-10 פעמים) עם פיפטת הזכוכית (קצוות פלסטיק יכולים לשמש כחלופה).
- הניחו לגלולה להתיישב בתחתית הצינור ואספו את המדיום בצינור חדש. מוסיפים 2 מ"ל של מדיום F12 טרי לצינור המכיל את הגלולה וחוזרים על הדיסוציאציה המכנית עם פיפטת הזכוכית. חזור על שלב זה עד שההשעיה הופכת הומוגנית (בערך 3-4 פעמים) ולאסוף את כל DRG מנותק בצינור החדש. שיטה זו מפחיתה את הלחץ הנובע מהדיסוציאציה המכנית ומשפרת את יכולת הקיום של הנוירונים.
- סנן את התרחיף ההומוגני שנוצר לתוך צינור חדש של 15 מ"ל באמצעות מסננת תאים של 100 מיקרומטר כדי להסיר נוירונים לא מנותקים ופסולת אחרת. בשלב זה, זה עשוי להיות נוח לסנן תחילה את תרחיף התא לתוך צינור 50 מ"ל ולאחר מכן להעביר את התמיסה לתוך צינור קטן יותר באמצעות פיפטה זכוכית. צנטריפוגה את המתלה ב 110 גרם במשך 5 דקות.
- הכן BSA של 15% על ידי הוספת 500 μl של תמיסת BSA 30% ל- 500 μl של מדיום F12. זרמו באיטיות את התמיסה במורד דופן צינורית של 15 מ"ל כדי ליצור שובל חלבונים הדרגתי. בשלב זה, כדאי להחזיק את הצינור בזווית של 45° ולשחרר לאט את ה-BSA תוך שימוש במספרים שעל צינור הבז כנקודת ייחוס ל"מסלול" המתהווה.
- שאפו את הסופרנאטנט משלב 2.10 תוך השארת 500 μl בתחתית הצינור והשעו מחדש את גלולת התא באותו תווך. החזירו באיטיות את המתלה לאורך שובל החלבונים שהוכן קודם לכן בשלב 2.11 (השתמשו במספרים שעל הצינור כנקודת ייחוס) ובצנטריפוגה במשקל 500 גרם למשך 5 דקות.
- לשאוף את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של BS שונה medium.
הערה: הנפח להשעיה מחדש של נוירוני DRG יכול להיות מורכב עד לנפח הנדרש בפועל, בהתאם לריכוז התא הסופי הרצוי ומספר הדגימות שיש לזרוע. חיה אחת תספק מספיק תאים לניסוי של 24 בארות.
- לדגור על דגימות זרעים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 2 שעות כדי לאפשר חיבור תאים ולבסוף להוסיף BS בינוני טרי בתוספת 50 ng / ml של NGF.
