Arborization הנוירונים הדנדריטים חושית של תסיסנית הזחל מערכת העצבים ההיקפית הם מודלים שימושי להבהיר הן בכלל נוירון מעמד ספציפי מנגנוני התמיינות נוירון. אנו מציגים מדריך מעשי ליצור ולנתח הדנדריטים נוירון arborization פסיפסים גנטית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי
במאמר זה
סיכום
תקציר
התפתחות מערכת העצבים מחייב את המפרט הנכון של נוירון עמדה וזהות, ואחריו התפתחות דנדריטים מדויק בכיתה ספציפית נוירון וחיווט axonal. לאחרונה הדנדריטי (DA) arborization עצב סנסורי של המערכת תסיסנית הזחל העצבים ההיקפית (PNS) הפכו מודלים גנטי חזק שבו להבהיר שני מנגנונים כלליים בכיתה ספציפית של בידול נוירון. ישנם ארבעה הראשי התובע כיתות נוירון (I-IV) 1. הם שם לפי סדר המורכבות הגוברת סוכת דנדריט, יש מעמד ספציפי ההבדלים בשליטה הגנטי של בידול שלהם 20-10. המערכת החושית התובע הוא מודל מעשי לחקור את המנגנונים המולקולריים מאחורי שליטתה של מורפולוגיה הדנדריטים 11-13 כי: 1) הוא יכול לנצל את הכלים גנטי חזק זמין זבוב הפירות, 2) התובע דנדריט נוירון סוכת פורשת רק 2 מימדים מתחת אופטית CLEלציפורן ar הזחל ולכן קל לדמיין עם רזולוציה גבוהה in vivo, 3) את המגוון בכיתה ספציפית במורפולוגיה הדנדריטים מאפשרת ניתוח השוואתי למצוא אלמנטים מרכזיים שליטה על היווצרות של עצים דנדריטים פשוט מול מסועפת מאוד, 4) סוכת הדנדריטים סטריאוטיפיות צורות שונות של נוירונים התובע להקל על ניתוחים סטטיסטיים morphometric.
פעילות התובע נוירון משנה את הפלט של גנרטור דפוס הזחל מרכזי תנועה 14-16. שונה התובע כיתות נוירון יש שיטות שונות חושית, והפעלה שלהם מעוררת תגובות התנהגותיות שונות 14,16-20. מעמדות שונים ועוד לשלוח תחזיות axonal סטריאוטיפי לתוך מערכת הזחל תסיסנית מרכזי העצבים בחוט עצב הגחון (VNC) 21. תחזיות אלו לסיים עם ייצוגים הטופוגרפי של מודליות הן התובע נוירון חושי את המיקום בקיר גוף השדה הדנדריטים 7,22, 23. לפיכך, בחינה של תחזיות התובע axonal יכול לשמש כדי להבהיר המנגנונים מיפוי טופוגרפי 7,22,23, כמו גם את החיווט של תנועה הזחל פשוט ויסות מעגל 14-17.
אנו מציגים כאן מדריך מעשי ליצור ולנתח פסיפסים גנטי 24 נוירונים סימון התובע באמצעות MARCM (ניתוח פסיפס עם מרקר תא Repressible) 1,10,25 ו Flp-out 22,26,27 טכניקות (מסוכם באיור. 1).
פרוטוקול
1.Preparation של ריאגנטים
- הכן Ca + + ללא HL3.1 מלוחים 28.
- במ"מ: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 סוכרוז, ו 5 trehalose; pH 7.2. סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C.
הערה: Ca + + ללא פתרון המונע התכווצות שרירים במהלך לנתיחה.
- במ"מ: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 סוכרוז, ו 5 trehalose; pH 7.2. סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C.
- הפוך את פולי-L-ליזין (PLL) coverslips.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הזחל תסיסנית מודל התובע נוירון מספקת מערכת אחת גנטי מעולה לחקור מנגנוני בקרה נוירון מורפולוגיה היווצרות מעגל. MARCM משמש בדרך כלל עבור תיוג ליצירת מוטציה התובע שיבוטים נוירון. עבור MARCM אנו משתמשים או מחבת-עצביים (למשל Gal4 c155) או התובע נוירון ספציפי הנהג. בעזרת הנהג הפאן עצביות אפשר להשתמש ישירות במניות מספר הנפוצה ממרכזי מניות לציבור. זאת באמצעות הנהג DA-נוירון מסוים יכול להיות יתרון, כי שיבוטים מסומן לא יופק במערכת העצבים המרכזית, ואת שיב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
המחברים מודים RIKEN למימון. אנו מודים גם Cagri Yalgin, קרוליין Delandre, וג'יי פריש לדיונים על פרוטוקולים גנטיים אימונוהיסטוכימיה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
|---|---|---|---|
| SZX16 לנתיחה מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עם GFPHQ לסנן) | אולימפוס | SZX16 | |
| חיים מלקחיים חרקים | FST | 26030-10 | |
| 26mm x 76mm דיכאון שקופיות זכוכית | Toshinriko ושות | T8-R004 | |
| Sylgard 184 (או Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| פולי-L-ליזין | סיגמא | P-1524 | מוצר זה הוכח כיעיל ביותר |
| DPX הרכבה בינונית | סיגמא | 44581 | |
| הארנב נגד ה-GFP | Invitrogen | A-11122 | דילול 1:500 |
| עכברוש אנטי CD8 | Caltag | 5H10 | דילול 1:200 |
| עכבר אנטי CD2 | AbD serotec | MCA443R | דילול 1:700 |
| עכבר אנטי Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | דילול 1:10 |
מקורות
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
