שיפור התמיינות תאי גזע באמצעות טיפול DMSO חולף

תקציר

מקור: Sambo, D. et al., טיפול חולף בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים עם DMSO לקידום התמיינות. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את השיטה לשיפור התמיינות תאי גזע באמצעות טיפול DMSO חולף, אשר עוצר תאים בשלב G1. לאחר הטיפול, מתווסף מדיום התמיינות אקטודרמלי עם מעכבי BMP ו- TGF-β כדי לקדם היווצרות מבשר עצבי.

פרוטוקול

1. תחזוקת תאי גזע

הערה: פרוטוקול תחזוקת התאים המתואר להלן חל על תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC) הנשמרים בשכבה חד-שכבתית דבקה. מדיה, ריאגנטים אחרים וצלחות תרבית תאים המשמשים לפני טיפול בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) ניתנים להתאמה לפי הצורך. עבור כל הפרוטוקולים הבאים בכתב יד זה, יש לטפל בתאים תחת ארון בטיחות ביולוגי.

1. מצפים צלחות סטריליות, 6 בארות, מטופלות בתרבית רקמה עם מטריצה או מצע מוסמך של תאי גזע פלוריפוטנטיים שהוכנו לפי הוראות היצרן ודגרו לפחות שעה באינקובטור CO₂ (5% CO₂, אטמוספירה לחה). צלחות מצופות ניתן לעטוף סרט ולאחסן ב 4 ° C עד שבוע אחד.
2. הפשירו את PSCs בהקפאה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. יש לעקר את הבקבוקון באתנול לפני הכנסתו לארון הבטיחות הביולוגי, ולאחר מכן להעביר מיד את התאים על ידי צנרת לצינור חרוטי סטרילי המכיל 5-10 נפחים של מדיה של תאי גזע שחוממו מראש.
3. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
4. שאפו את המדיה והשעו מחדש בעדינות את כדורית התא ב-1 מ"ל של מדיה של תאי גזע בתוספת מעכב חלבון קינאז (ROCK) הקשור ל-10 מיקרומטר RHO, כגון Y-27632.
5. שאפו את מטריצת התרבית מהצלחת וזרעו את התאים בצפיפות הרצויה, בדרך כלל 0.5-1 x 10⁶ תאים לבאר בלפחות 2 מ"ל של מדיה של תאי גזע לכל באר.
   הערה: צפיפות הציפוי יכולה להשתנות בין קווי תאים ושיבוטים שונים ויש למטב אותה בהתאם.
6. שמור על התאים על ידי החלפה עם מדיה תאי גזע שחוממו מראש מדי יום. לפצל את התאים בערך 70%-80% מפגש או כאשר מושבות התאים מתחילות ליצור קשר.
7. לפיצול תאים, שאפו את המדיה ושטפו את התאים פעם אחת במי מלח סטריליים חוצצים פוספט (PBS). לדגור את התאים עם 1 מ"ל של תמיסת אנזים דיסוציאציה לכל באר במשך 5-10 דקות ב 37 ° C.
8. שטפו והשעו מחדש את התאים עם מדיה של תאי גזע שחוממו מראש והעבירו לצינור חרוטי סטרילי עם 5-10 נפחים של מדיה של תאי גזע. בצע את שלבים 1.3-1.7 כדי לסדר את התאים.

2. טיפול מקדים ב-DMSO

הערה: בעת ציפוי התאים לטיפול מקדים ב-DMSO לפני ההתמיינות, יש למטב את צפיפות תאי הציפוי ההתחלתית תוך התחשבות בקצב הצמיחה האופייני של קו תאי הגזע וכן בפרוטוקול ההתמיינות הנמצא בשימוש. אימות פלוריפוטנציה באמצעות סמנים קונבנציונליים, לפי הצורך. תאים צריכים לעבור לפחות 1x-2x לאחר ההפשרה הראשונית לפני ההתמיינות.

1. בידול תרבות דו-ממדי
   1. כאשר התאים מגיעים למפגש מתאים, הכינו לוחות מצופים, נתקו את התאים והכינו תרחיף חד-תאי כמתואר לעיל.
   2. ספור את התאים החיים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי, כולל טריפאן, כחול או סמן כדאיות אחר.
   3. צלחת את התאים על צלחת מצופה 6 באר ב 0.5-1 x 10⁶ תאים לכל באר במדיה תאי גזע עם מעכב 10 μM ROCK.
      הערה: עבור קווי התאים שנבדקו במעבדה שלנו, צפיפויות אלה בדרך כלל הביאו לתאים מתמזגים של 80%-90% בתוך טיפול מקדים DMSO של 24 שעות.
   4. לאפשר לתאים לדגור במשך 24 שעות ב 37 ° C באינקובטור CO₂ (5% CO₂, אטמוספירה לחה).
   5. הכינו 1%-2% DMSO במדיה של תאי גזע שחוממו מראש (למשל, 100 מיקרוליטר DMSO ב-10 מ"ל מדיה = 1% תמיסת DMSO, או 200 מיקרוליטר DMSO ב-10 מ"ל מדיה = 2% תמיסת DMSO).
   6. לאחר דגירה של 24 שעות, שאפו את המדיה מתאים והחליפו אותה בתמיסת DMSO.
   7. אפשרו לתאים לדגור במשך 24 שעות עד 48 שעות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור CO₂ (5% CO₂, אטמוספירה לחה) לפני ההתמיינות.
      הערה: בדרך כלל, טיפול DMSO של 24 שעות מספיק ברוב קווי תאי גזע עובריים ומושרים אנושיים (ESC ו- iPSC). קווי תאים עם קצב צמיחה איטי מאוד (זמני הכפלה ארוכים) יכולים להפיק תועלת מהדגירה של 48 שעות עם DMSO. עבור דגירה של 48 שעות עם DMSO, ניתן להחליף מדיה במדיה של תאי גזע טריים עם 1%-2% DMSO לאחר 24 השעות הראשונות של הטיפול.

3. דיפרנציאציה לשכבות נבט ראשוניות

הערה: להלן מתוארות שיטות שהוכחו בעבר כיעילות במעבדה שלנו עבור PSCs הגדלים בשכבה אחת על 6 צלחות באר. יש להשתמש בכל פרוטוקול בידול לפי בחירה לאחר טיפול DMSO כדי לקדם התמיינות לשושלות רצויות. הסר את תמיסת DMSO לאחר טיפול של 24-48 שעות והמשך בהבחנה בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים.

1. הבחנה אקטודרם
   1. טפל בתאים עם DMSO כמתואר לעיל עבור תרביות דו-ממדיות.
   2. הכינו פתרונות מלאי של Noggin ו-SB431542.
   3. הכינו את מדיית הבסיס של התמיינות אקטודרמלית על ידי המסת תחליף סרום נוקאאוט (KOSR) לריכוז סופי של 10% במדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco.
      הערה: הכינו מספיק מדיה בסיסית ל-3-4 ימים של החלפת מדיה.
   4. הכן אמצעי התמיינות אקטודרמלי על ידי הוספת Noggin לריכוז סופי של 500 ng/mL ו- SB431542 לריכוז סופי של 10 μM לנפח המתאים של KOSR / נוקאאוט DMEM שחומם מראש.
   5. לאחר טיפול מקדים ב-DMSO, יש לשאוב מדיה מתאים ולהחליף באמצעי התמיינות (למשל, 2 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות).
   6. אפשרו לתאים לדגור במשך 3-4 ימים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור CO₂ (5% CO₂, אטמוספירה לחה), והחליפו את המדיה מדי יום בגורמי התמיינות חדשים שנוספו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית תאים רב-באר שטוחה שטוחה 6 בארות מטופלת TC	קורנינג	353046
מונה תאים אוטומטי Countess II FL	תרמו פישר סיינטיפיק	AMQAF1000
DMEM/F-12	גיבקו	11320033
DMSO	סיגמא-אולדריץ'	D2650
נוקאאוט DMEM	גיבקו	10829018
תחליף סרום נוקאאוט	גיבקו	10828028
מטריג'ל מטריקס	קורנינג	354277
Noggin Fc חלבון כימרה	מערכות מו"פ	3344-NG-050
SB431542	סטמג'נט	04-0010
מיקרו-צלחות חיבור נמוכות במיוחד	קורנינג	3471
Y-27632	טכנולוגיות StemCell	72302