$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. הכנת מאגרי דיסקציה ומדיה תרבותית
- לבידוד חוט השדרה של חולדה, הכינו חיץ דיסקציה של 100 מ"ל (1x PBS + 0.6% גלוקוז + 2% פניצילין-סטרפטומיצין) והכניסו למקרר.
- הכינו 100 מ"ל ללא סרום בינוני (SFM) וחממו בחום של 37°C. להכנת SFM, יש להוסיף 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, 2% B27 ו-10% תערובת הורמונים למדיום Neurobasal-A. להכנת תערובת הורמונים, הכינו מדיום 1:1 DMEM/F12 המכיל 0.6% גלוקוז, 3 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, 25 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 100 מיקרוגרם/מ"ל אפו-טרנספרין, 10 מיקרומטר פוטרסין, 30 ננומטר סלניום ופרוגסטרון 20 ננומטר.
- הכינו את מצע הציפוי המועשר במקדם גדילה EFH (ל-SFM הוסיפו 20 נ"ג/מ"ל EGF, 20 נ"ג/מ"ל bFGF ו-2 מיקרוגרם/מ"ל הפרין) וחממו ב-37°C.
2. קציר וכריתה של רקמת חוט השדרה הפריבנטריקולרית של חולדה בוגרת
- לעקר מכשירי ניתוח באתנול ולשטוף במי מלח סטריליים, או מכשירים אוטוקלאביים מראש. תנו לחולדות (בנות 6-8 שבועות) זריקה קטלנית של נתרן פנטוברביטל (1 סמ"ק ב-65 מ"ג/מ"ל) או מנת יתר של חומר הרדמה (כלומר, 4% איזופלורן) בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים שאושר על ידי המוסד. לטבול את החלק האחורי של החולדה עם 70% אתנול ולהסיר את העור על פני השטח הגבי עם מספריים דיסקציה גדולה.
- מחזיק את המספריים בניצב למשטח הגבי, חותך לרוחב את עמוד השדרה מעל הגפיים האחוריות. השתמש במספריים קטנים יותר כדי לחתוך לאורך את השריר הגבי מעל עמוד השדרה בכיוון רוסטרלי כדי לחשוף את התהליכים בעמוד השדרה.
- החל מהקצה הקאודלי החשוף, הכנס רונג'ורים או מכשיר חיתוך עצם קהה קטן אקסטרה-דורלי לתוך האספקט הצידי של תעלת עמוד השדרה ברווח שבין חוט השדרה לעמוד השדרה. בצעו חתכים קטנים לתוך הלמינה (קשתות גרמיות משמאל ומימין לתהליכים בעמוד השדרה בכל צד של החוליות) וקילפו בזהירות את הלמינה כדי לחשוף את חוט השדרה (איור 1A-D). ודא שזווית הלהבים רדודה ומקבילה לחוט כדי שחוט השדרה התחתון לא ייפגע.
- המשך למינקטומיה בכיוון הרוסטרלי כדי לחשוף את חוט השדרה החזי והצווארי.
- הוציאו בעדינות את חוט השדרה מעמוד השדרה באמצעות מלקחיים קהים והשתמשו במיקרומספריים כדי לחתוך בזהירות את השורשים כדי לשחרר את החבל. הניחו את חוט השדרה הנכרת בצלוחית פטרי המכילה חיץ דיסקציה סטרילי של חולדה בטמפרטורה של 4°C (המתואר לעיל ב-1.1). שטפו את הרקמה בחיץ חיתוך טרי של 4°C וחתכו את חוט השדרה לרוחב למקטעים של 1 ס"מ באמצעות מספריים (איור 1E).
- עבור כל מקטע של רקמה, השתמש ביד אחת כדי להחזיק את הרקמה עם מלקחיים עדינים. מצד שני, השתמשו במיקרומספריים כדי להסיר בזהירות את קרומי המוח, החומר הלבן ואת רוב החומר האפור בעזרת היקף ניתוח. לחלופין, השתמשו במלקחיים עדינים (Dumont #4) כדי לקלף את רוב החומר האפור והלבן, ולהשאיר רק את האזור הפרי-וונטריקולרי של חוט השדרה הכולל את האפנדימה וכמות קטנה של חומר אפור מסביב (איור 1F-H).
- אגרו את הרקמה הפרי-חדרית המנותחת לתוך צלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 ס"מ המכילה חיץ דיסקציה של חולדות קרות.
3. בידוד וגידול של NSPCs חוט השדרה של חולדה בוגרת
- בצע את השלבים הבאים באופן אספטי במכסה מנוע זרימה למינרית.
- לטחון את הרקמה periventricular חולדה מנותח לחתיכות 1 מ"מ עם microscissors.
- נתק אנזימטית את הרקמה הטחונה עם אנזימים מפרקי חלבון באמצעות ערכת דיסוציאציה פפאין כפי שמצוין בטבלת החומרים/ריאגנטים.
הערה: רכיבי המגיב כוללים ארבעה בקבוקונים: בקבוקון 1: תמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS). בקבוקון 2: פפאין המכיל L-ציסטאין ו-EDTA. בקבוקון 3: Deoxyribonuclease I (DNase). בקבוקון 4: מעכב פרוטאז Ovomucoid עם אלבומין בסרום בקר (BSA).
הערה: פפאין הוא פרוטאז סולפידריל עם ספציפיות רחבה למצעי חלבון. הפפאין המופק מהלטקס של צמח הפפאיה Carica ומפרק את רוב מצעי החלבונים באופן נרחב יותר מאשר פרוטאזות הלבלב. במהלך תהליך הדיסוציאציה, יש נזק מסוים לתאים הגורם לדנ"א להשתחרר למדיום הדיסוציאציה, מה שיגביר את הצמיגות ויקשה על הפיפטציה. לפיכך, DNase נכלל בהליך בידוד התא כדי לעכל את הדנ"א מבלי לפגוע בתאים השלמים. Ovomucoids הם מעכבי פרוטאז גליקופרוטאין המשמשים לעיכוב פעילות פפאין לאחר שלב הדיסוציאציה.
- בשימוש הראשון, לבנות מחדש את תערובת מעכבי אלבומין ovomucoid (בקבוקון 4) עם 32 מ"ל של EBSS (בקבוקון 1), ולאחר מכן לאחסן ב 4 ° C ולהשתמש עבור בידודים הבאים. הערה: זה מניב תמיסה בריכוז יעיל של 10 מ"ג של מעכב ovomucoid ו 10 מ"ג אלבומין לכל מ"ל.
- הוסף 5 מ"ל של EBSS (בקבוקון 1) לבקבוקון פפאין (בקבוקון 2), והניב תמיסה ב 20 יחידות של פפאין/מ"ל ב 1 mM L-ציסטאין עם 0.5 mM EDTA. בדוק כי פתרון פפאין נראה ברור כאשר מומס לחלוטין. אחרת, מניחים את הבקבוקון באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך עשר דקות עד שהפפאין מומס לחלוטין כדי להבטיח את הפעילות הכוללת של האנזים.
- הוסף 500 μl של EBSS (בקבוקון 1) לבקבוקון DNase (בקבוקון 3) וערבב בעדינות מכיוון ש- DNase רגיש לדנטורציה גזירה. הוסף 250 μl של תמיסת DNase לבקבוקון פפאין, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של כ 20 יחידות / מ"ל פפאין ו 0.005% DNase. שמור את ה- DNAse הנותר לשימוש מאוחר יותר.
- מניחים את רקמת החולדה הטחונה בתמיסת הפפאין.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם תסיסה מתמדת על משטח נדנדה כדי לנתק את הרקמה בתמיסת הפפאין הפעילה. לדגור על רקמת חולדה למשך 45 דקות עד שעה.
- Triturate את התערובת עם פיפטה 10 מ"ל כדי לנתק את כל חתיכות הרקמה הנותרות כדי לייצר תרחיף תאים עכור. העבר את מתלה התא (אל תכלול חתיכות של רקמה לא מנותקת) לתוך צינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
- להשעות מחדש את התאים pelleted בתווך המכיל ovomucoid, מעכב פפאין.
- הכן את הפתרון ovomucoid על ידי ערבוב 2.7 מ"ל EBSS (בקבוקון 1) עם 300 μl של תמיסת מעכב אלבומין-ovomucoid reconstituted (בקבוקון 4) בצינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 150 μl של תמיסת DNase (בקבוקון 3).
- השליכו את הסופרנאטנט מהתאים הכדוריים ומיד השהו מחדש את כדורית התא בתערובת מעכבי אלבומין DNase המדוללת.
- הפרדת תאים שלמים מקרום התא באמצעות צנטריפוגה באמצעות שיפוע צפיפות לא רציף בצעד אחד.
- הכינו את שיפוע הצפיפות הלא רציף על ידי הוספת 5 מ"ל של תמיסת מעכבי אלבומין (בקבוקון 4) לצינור של 15 מ"ל, ובאמצעות פיפטה של 5 מ"ל, שכבו בעדינות ובאיטיות את תרחיף התא (שהוכן כמתואר לעיל) על גבי תמיסת מעכבי אלבומין.
- צנטריפוגה ב 70 x גרם במשך 6 דקות ב RT.
הערה: הממשק בין שתי השכבות של מעבר הצבע צריך להיות גלוי בבירור, אם כי ערבוב מינימלי בגבול זה אינו משפיע על התוצאה. שברי קרום נשארים בממשק ותאים מנותקים מתגלגלים בתחתית הצינור.
- יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום EFH של חולדה (מחומם מראש ב-37°C). ספרו את צפיפות התאים החיים בעזרת המוציטומטר והכניסו את התאים לבקבוק תרבית T25 בצפיפות של 10 תאים/μl ב-EFH. התשואה האופיינית של תאים מרקמת חולדה היא בערך 2 x 106 תאים עם כ 80% כדאיות. אם רוצים תרביות משובטים, זרעו תאים בצפיפות של פחות מ-10 תאים/μl. לדגור על צלוחיות ב 37 ° C ב 5% CO2 ולאפשר את התרביות לגדול ללא הפרעה במשך 1 שבוע כדי למנוע צבירה של כדורים.
