בידוד וטיפוח פריציטים מוחיים של עכברים

תקציר

מקור: Mehra, A., et al., A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד פריציטים מוחיים ממוח עכבר. התאים המבודדים מתורבתים במדיה ספציפית לפריציטים כדי לקדם את התפשטות הפריציטים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הכנת פתרונות

1. הכינו 500 מ"ל של חיץ כביסה A (WBA): תמיסת HEPES של 10 מ"מ בתמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של Hank. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
2. הכינו 500 מ"ל של חיץ כביסה B (WBB): אלבומין סרום בקר 0.1% (BSA) עם תמיסת HEPES של 10 mM ב-HBSS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
3. הכינו 300 מ"ל של תמיסת דקסטרן 30% ב-WBA על ידי ערבוב התמיסה למשך הלילה בטמפרטורת החדר. יש לאטום את התמיסה בטמפרטורה של 110°C למשך 30 דקות לפני השימוש. לאחר autoclaving, תן את הפתרון לנוח בטמפרטורת החדר במשך 2-3 שעות. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
4. הכן 100 מ"ל של תמיסת BSA 0.1% בתמיסת דקסטרן קרה. יש לנער נמרצות במשך 3-4 דקות ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
5. הכינו את מדיית התרבית Modified Eagle Medium (DMEM) המלאה של Dulbecco על ידי המסת 20% סרום עגל, 2 mM גלוטמין, 50 מיקרוגרם/מ"ל gentamycin, 1% ויטמינים, 2% חומצות אמינו Basal Medium Eagle (BME) במדיית DMEM בסיסית ואחסנו בטמפרטורה של 4°C. יש להוסיף 1 נ"ג/מ"ל גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי (bFGF) לפני השימוש.
6. הכינו מדיה מלאה של פריציט על ידי הוספת תוספי גדילה של פריציטים (מסופקים עם המדיה של פריציט) וסרום עגל עוברי 20% (FCS) במדיה הבסיסית של תרבית פריציט ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.

2. שחזור רקמת המוח והסרת קרומי המוח

1. לקבלת עקביות, השתמש בעכברים בגיל דומה ובאותו מין בכל אצווה של מיצוי. השתמש במקלט לבעלי חיים ללא פתוגנים וספק גישה למים. כדי להבטיח יעילות ושימוש מינימלי בבעלי חיים, הימנעו מאובדן חומר רקמות.
2. המתת חסד C57BL/6J, עכברים זכרים בני 4-6 שבועות (מעבדות Janvier, Le Genest-Saint-Isle, צרפת).
3. במהירות הבלו את רקמת המוח בתנאים סטריליים, למנוע כל נזק לרקמה. בזהירות למקם את הרקמה 40 מ"ל של פוספט קר buffered מלוחים (PBS).
4. מעבירים את רקמת המוח ב-PBS קר לצלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ).
5. הניחו את רקמת המוח על מגבון סטרילי יבש ללא סיבים ובעזרת מלקחיים מעוקלים, הסירו את המוח הקטן, הסטריאטום והעצבים העורפיים.
   1. הסר את כל קרומי המוח הנראים לעין עם צמר גפן. הניחו את רקמת המוח הפוכה ופתחו את האונות בעזרת צמר גפן באמצעות משיכות קלות כלפי חוץ. הסר את כל כלי הדם הגלויים.
   2. מניחים את רקמת המוח נטולת קרומי המוח בצלוחית פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) עם 15 מ"ל של WBB קר.

3. הומוגניזציה

1. מעבירים את הרקמה לצינור טיט מטחנת רקמות Dounce ומוסיפים 3-4 מ"ל של WBB עם מלקחיים.
2. טחנו את הרקמה עם מזיק 'רופף' 55 פעמים. שטפו את המזיק 'הרפוי' עם WBB. עכשיו לטחון את slurry עם מזיק "הדוק" 25 פעמים.
3. מחלקים את הבוצה באופן שווה לשתי שפופרות של 50 מ"ל ומוסיפים נפח פי 1.5 של BSA-דקסטרן קר 30%, תוך ניעור נמרץ של הצינורות כדי לערבב את הבוצה.

4. בידוד של החלק הווסקולרי

1. לאחר ניעור נמרץ של הצינורות, צנטריפוגו את הצינורות למשך 25 דקות בטמפרטורה של 3,000 x גרם ו -4 מעלות צלזיוס.
2. מעבירים את הסופרנאטנט (יחד עם שכבת המיאלין העליונה) ל-2 צינורות חדשים, וצנטריפוגות את הצינורות למשך 25 דקות בטמפרטורה של 3,000 x גרם ו-4°C. שומרים על הכדוריות מהצנטריפוגה הראשונה על ידי הוספת 3 מ"ל של WBB קר (שומרים את הגלולה על 4°C).
3. חזור על שלב 4.2 ושמור בזהירות על הכדוריות מהצנטריפוגה השנייה.
4. השליכו את הדקסטרן ואת המיאלין עם שאריות רקמות מהצינורות משלב 4.3. שומרים את הכדוריות ב-WBB קר.
5. אחסן את תכולת צינור 1 וצינור 2 משלב 4.1 והפוך עד נפח סופי של 10 מ"ל עם WBB קר.
6. חזור על שלב זה עבור צינורות משלב 4.2 ושלב 4.3.
   הערה: לבסוף, ישנם 3 צינורות מ 3 צנטריפוגציות.
7. נתקו את הגלולה באמצעות 6 משיכות מעלה ומטה באמצעות פיפטה של 10 מ"ל עד שלא יישארו גושים נראים לעין של כדורים.
8. סנן את מתלי התאים של כל צינור באמצעות מכלול מסנן ואקום ומסנן רשת ניילון.
   הערה: שלב סינון זה חשוב על מנת להסיר כלים ארוכים/גדולים יותר דרך מסנן הרשת.
9. לשחזר ולהשעות מחדש את הנימים על ידי גירוד המסנן בעזרת מלקחיים קצה שטוח או מגרד ב WBB בטמפרטורת החדר. סנן את המתלים עם מסנן טרי כדי לשחזר נימים נוספים
10. חלק את הסינון באופן שווה לשני צינורות וצנטריפוגה למשך 7 דקות ב- 1,000 x גרם ו- RT.
    הערה: במהלך שלב צנטריפוגה זה, הכן את התמיסה האנזימטית. קבע את נפח WBB הדרוש בהתאם למספר בעלי החיים בשימוש (ראה טבלת חומרים). יש להוסיף 1x של DNase 1 ו-1x של Tosyl-L-lysyl-chloromethane hydrochloride (TLCK) (ראו טבלת חומרים) ב-WBB ולחמם מראש ל-37°C.
11. אספו את הכדוריות משלב 4.10 בצינור אחד עם WBB שחומם מראש עם אנזימים. מוסיפים 1x collagenase/dispase שחומם מראש. הניחו את הצינור באמבט המים הרועד בטמפרטורה של 37°C למשך 33 דקות בדיוק.
12. עצור את תגובת האנזים על ידי הוספת 30 מ"ל של WBB קר. צנטריפוגה את המתלים למשך 7 דקות במהירות של 1,000 x גרם ו-RT.
13. יש להשליך את הסופרנאטנט בזהירות ולנתק את הגלולה ב-WBB עם 6 משיכות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. צעד זה צריך להיות פחות קפדני ומהיר יחסית.
14. צנטריפוגה את המתלים למשך 7 דקות ב-1,000 x גרם ו-RT.
    הערה: במהלך שלב זה, השליכו את הציפוי מכלי התרבית ושטפו אותם פעם אחת עם DMEM בטמפרטורת החדר. מעיל צלחות תרבית תאים לפחות 1 שעה ב RT.
15. יש להשליך את הסופרנאטנט מהצינור שהתקבל בשלב 4.14, ולנתק את הגלולה במדיית DMEM שלמה חדשה, לצלחת את התאים (יום 0, P0) ב-9 בארות של לוחות 6 בארות (באר אחת של 9.6 סמ"ר כל אחת).

5. התפשטות פריציטים מוחיים

1. שמור על תרביות התאים ב 37 ° C ו 5% CO₂ באינקובטור סטרילי. החלף את אמצעי התרבית לאחר 24 שעות (יום 1) של ציפוי התאים על ידי הסרת בזהירות את הפסולת. לאחר היום הראשון, לשנות את מדיה תרבות בכל 48 שעות.
2. התבונן בתרבית התא לפחות 7-8 ימים. בשלב זה, גידולים תאיים בחלק העליון של חד-שכבתית אנדותל צריכים להיות ניתנים לצפייה.
3. עוברים את התאים ביום 8-10 (תלוי במפגש) בתווך תרבית פריציטים למעבר 1 (P1) על לוחות תרבית מצופים ג'לטין. החליפו את מדיית התרבות כל יומיים. התבונן בתאים במשך 6-7 ימים. התאים מפוצלים שוב ברציפות למעבר 2 (P2) ביום 17 [ומעבר 3 (P3) ביום 24 רק במידת הצורך], גדל בתווך פריציטים בלוחות מצופים ג'לטין.
   הערה: התאים יהיו מוכנים לניסויים/תצפיות במפגש של כמעט 80-90%.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומצות אמינו BME	סיגמא	B-6766	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
מדיית DMEM בסיסית	Invitrogen	316000083	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
גורם גדילה פיברובלסט בסיסי	סיגמא	F-0291	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
BSA	סיגמא	A-8412	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
קולגנאז דיספאס	סיגמא	10269638001	הכינו תמיסת מלאי 10x ב-PBS-CMF סטרילי. סננו את התמיסה עם מסנן מזרקים 0.22 מיקרומטר ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הערה: לשלב עיכול האנזימים של הפרוטוקול, עבור כל קבוצה של 10 עכברים למיצוי, נדרשים 300 μL של 10x collagenase dispase.
דקסטרן	סיגמא	31398
DNase I	סיגמא	11284932001	הכינו תמיסת מלאי 1000X על ידי המסת 100 מ"ג במים סטריליים של 10 מ"ל ואחסנו בטמפרטורה של -20°C.
ג'לטין	סיגמא	G-2500	הכינו את ציפוי העבודה על ידי יצירת תמיסת ג'לטין 0.2% ב-PBS-CMF סטרילי (8 גרם/ליטר NaCl, 0.2 גרם/ליטר KCl, 0.2 גרם/ליטר KH2PO4, 2.86 גרם/ליטר NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave את הפתרון במשך 20 דקות לפחות ב 120 ° C ולאחסן בטמפרטורת החדר. תרבית מנות להיות מצופה לפחות 4 שעות ב 4 ° C.
ג'נטמיצין	Biochrom AG	A-2712	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
גלוטמין	מרק	I.00289	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
HBSS	סיגמא	H-8264	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
HEPES	סיגמא	H-0887	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
מטריג'ל	BD מעיל ביולוגי	354230	הכינו תמיסת ציפוי עובדת של מטריג'ל על ידי דילול מלאי ב-DMEM קר ביחס של 1:48 כאשר הריכוז הסופי שלו הוא 85 מק"ג/סמ"ר. צלחות תרבית תאים צריך להיות מצופה לפחות 1 שעה בטמפרטורת החדר.
Pericyte עכבר בינוני	מעבדות מחקר Sciencell	1231	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
טוסיל ליזין כלורומתיל קטון	סיגמא	T-7254	הכן תמיסת מלאי 1000X ב- WBA על ידי המסת 16 מ"ג ב- 10.88 מ"ל של WBA כדי ליצור תמיסה של 4 מ"מ ולאחסן ב- 4 מעלות צלזיוס.
ויטמינים	סיגמא	B-6891	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
כלי סינון	ספר, רשת ניילון, נקבוביות 60 מיקרון
ציוד מעבדה	צנטריפוגת רוטור דלי נדנדה
אמבט מים עם מסית
מכסה מנוע זרימה למינרי : BSL2
כלי זכוכית (כל הרכיבים יעברו חיטוי בחום)	להקפיץ מטחנת רקמות עם זכוכית Pestle
Pestle I: 0.0035 - 0.0065 אינץ '
פשטל II: 0.0010 - 0.0030 אינץ '
מכלול מסנן ואקום עם נקבוביות גסות בסיס תמיכה של מסנן זכוכית מרוטשת