השגת תרחיף חד-תאי מרקמת ההיפוקמפוס של העכבר

תקציר

מקור: Trujillo, M., et al. דיסוציאציה מכנית ואנזימטית משולבת של רקמת מוח עכבר בהיפוקמפוס. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים פרוטוקול להשגת תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר מההיפוקמפוס במוח העכבר באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית אוטומטית ותערובת של אנזימים כדי לסייע בעיכול אנזימטי.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הכינו תערובת אנזימים 1 ו-2 לכל דגימה

הערה: עבור נפחים גדולים מ- 2 מ"ל, השתמש בפיפט סרולוגי של 10 מ"ל; עבור נפחים, 200 μL-2 מ"ל, השתמש פיפטה 1000 μL; עבור נפחים, 21-199 μL, להשתמש פיפטה 200 μL; עבור נפחים, 2-20 μL, להשתמש פיפטה 20 μL; עבור נפחים מתחת ל -2 μL, השתמש פיפטה 0-2 μL.

1. עבור כל דגימה, יש להפשיר אליציטוט אחד של אנזים P ואנזים A בטמפרטורת החדר.
2. לתערובת אנזימים 1, יש לערבב 50 μL של אנזים P ו-1900 μL של Buffer Z בצינור C (Table of Materials) שכותרתו.
3. לתערובת אנזימים 2, יש להוסיף 20 μL של Buffer Y לאליקוט המופשר של 10 μL של אנזים A.

2. פרוטוקול דיסוציאציה מוחית למבוגרים

הערה: בעת עבודה עם דגימות, יש למקם שפופרות במדף צינורות בטמפרטורת החדר בעוד BSA ו- D-PBS נשארים על קרח אלא אם כן צוין אחרת.

1. הפעל את הדיסוציאטור.
2. השתמש במלקחיים כדי להעביר את חתיכות רקמת ההיפוקמפי לצינור C.
3. מעבירים 30 μL של אנזים לערבב 2 לתוך צינור C. סובבו את המכסה עד להרגשת מתח, ואז הדקו עד שהוא לוחץ.
4. הניחו את צינור C הפוך במיקום של הדיסוציאטור; הדגימה תקבל את המצב שנבחר (איור 1). הדקו את תנור החימום מעל צינור C.
5. לחץ על סמל התיקייה, בחר תיקיית מועדפים, גלול אל תוכנית 37C_ABDK_02 ובחר אותה. לחץ על אישור כדי להחיל את התוכנית על כל צינורות C שנבחרו, ולאחר מכן הקש על התחל (איור 1).
6. סמן צינור חרוטי אחד של 50 מ"ל לכל דגימה.
7. מניחים מסננת תאים של 70 מיקרומטר על כל צינור חרוטי של 50 מ"ל ורטובים עם 2 מ"ל של חיץ BSA.
8. עם השלמת התוכנית, להסיר את התנור ואת צינור C מן dissociator.
9. הוסף 4 מ"ל של חיץ BSA לדגימה והחל את התערובת על מסננת התא על צינור חרוטי 50 מ"ל.
10. הוסף 10 מ"ל של D-PBS לצינור C, סגור אותו וסובב את התמיסה בעדינות. החל אותו על מסננת התא על צינור חרוטי 50 מ"ל.
11. השליכו את מסננת התאים ואת צינור C. צנטריפוגה את המתלים ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C. לאחר מכן, שאפו והשליכו את הסופר-נאנט.

3. פינוי פסולת

1. להשעות את הגלולה עם 1550 μL של D-PBS קר ולהעביר את ההשעיה לצינור חרוטי 15 מ"ל מסומן.
2. הוסף 450 μL של תמיסת הסרת פסולת קרה ופיפטה למעלה ולמטה (לא מערבולת).
   הערה: פתרון להסרת פסולת הוא מגיב בערכת הדיסוציאציה המסחרית למבוגרים בריאן.
3. שכבו בעדינות 1 מ"ל של D-PBS קר על גבי מתלה התא, תוך שמירה על הקצה כנגד דופן הצינור החרוט. חזור על הפעולה עד שהשכבה הכוללת היא 2 mL.
   הערה: צעד זה הוא קריטי; לבצע במיומנות ובמיומנות.
4. צנטריפוגה ב-3000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C עם האצה מלאה ובלם מלא.
   הערה: אם השלבים אינם מופרדים בבירור, חזור על שלבים 7.2-7.3. צנטריפוגה בפעם האחרונה ב 1000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
5. המתלה אמור כעת להיות מורכב משלוש שכבות נפרדות (איור 2). שאפו את השכבה העליונה. טאטאו את קצה הפיפטה קדימה ואחורה כדי לשאוף את השכבה האמצעית הלבנה. הסירו כמה שיותר מהשכבה האמצעית מבלי להפריע לשכבה התחתונה ביותר.
   הערה: צעד זה הוא קריטי; לבצע במיומנות ובמיומנות.
6. מוסיפים 2 מ"ל של D-PBS קר ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
7. צנטריפוגה במהירות 1000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C עם האצה מלאה ובלם מלא. שאפו והשליכו את הסופר-נאנט. השהה מחדש את הגלולה ב- 1 מ"ל של מאגר BSA.
   הערה: ניתן להשהות מחדש תאים במאגר המתאים ואז לתייג ולבודד אותם מגנטית כהכנה לריצוף של תא בודד בשלב זה.

תוצאות

איור 1: המצב שנבחר בשלב 2.4

איור 2: תרחיף תלת-שכבתי בשלב 3.5: חיץ (שכבה עליונה), פסולת תאים, תמיסת פינוי פסולת ותאים (שכבה תחתונה).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגות	פישר סיינטיפיק	02-682-003	Basix, צבעים שונים
15 מ"ל צינורות בז	Becton Dickinson Labware אירופה	352009	פוליסטירן
25 מ"ל פילים סרולוגיים	פישר סיינטיפיק	14-955-235
מסננת תאים 70 מיקרומטר	פישר סיינטיפיק	08-771-2
ערכת דיסוציאציה מוחית למבוגרים	Miltenyi ביוטק	130-107-677	מכיל אנזים P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, פתרון לפינוי פסולת
BSA	סיגמא-אולדריץ'	A7906-50G
בז 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטית	פישר סיינטיפיק	14-432-22
צינורות עדיניםMACS C	Miltenyi ביוטק	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator עם תנורי חימום	Miltenyi ביוטק	130-096-427
DPBS Gibco (1X)	תרמופישר סיינטיפיק	14190144
זכוכית	פישר סיינטיפיק	02-555-25א
טיפים פיפטה GP LTS 20 μL 960A/10	ריינין	30389270
טיפים פיפטה GP LTS 250 μL 960A/10	ריינין	30389277
טיפים פיפטה RT LTS 1000 μL FL 768A/8	ריינין	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 מיקרוליטר)	ריינין	30386597
דלי קרח עגול עם מכסה	פישר סיינטיפיק	07-210-129
צינורות בעלי תחתית עגולה עם מכסה מסננת תאים	בז	100-0087