הכנת תרחיף חד-תאי של תאי מערכת החיסון מרקמת המוח המורין

תקציר

מקור: DiSano, K. D., et al. בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון. J. Vis. Exp. (2020).

הסרטון מדגים הכנה של תרחיף חד-תאי של תאי חיסון מרקמת מוח מורינה. זה כרוך בעיכול אנזימטי כדי לשחרר תאים מרקמת המוח, ואחריו צנטריפוגה הדרגתית צפיפות כדי לבודד את תאי החיסון על בסיס הצפיפות שלהם כדי לקבל את ההשעיה של תא יחיד.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הכנת תרחיפים חד-תאיים של רקמת המוח וחוט השדרה

1. העבר את רקמת המוח או חוט השדרה עם מדיה לחלק העליון של צלחת פטרי 100 מ"מ על ידי יציקת הרקמה והמדיה מהצינור. בעזרת מלקחיים, להעביר את הרקמה לתחתית צלחת פטרי. לטחון דק את המוח או חוט השדרה עם סכין גילוח סטרילי. באמצעות סכין הגילוח, העבר את הרקמה הטחונה לתחתית הצלחת על ידי גירוד כדי לאסוף את הרקמה.
   הערה: עבור פרוטוקול העיכול האנזימטי להלן, ניתן לאחד עד שני חוטי שדרה יחד לצורך עיבוד. המוח צריך להיות מעובד בנפרד.
2. באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל, להוסיף 3 מ"ל של RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium (בתוספת 10% סרום עגל עוברי (FCS) לצלחת פטרי. באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל, פיפטה למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את הרקמה במדיה ולהעביר לצינור חרוטי 15 מ"ל.
   הערה: אם היישום במורד הזרם הוא ניתוח ריצוף RNA חד-תאי או בתפזורת או תרבית תאים, יש לבדוק את מגרשי FCS כדי להבטיח שהתאים אינם מופעלים לפני הניתוח. לחלופין, ניתן לעבד תאים באמצעות 1x PBS עם 0.04% BSA במקום RPMI עם 10% FCS.
3. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, שטפו את צלחת הפטרי עם 2 מ"ל נוספים של מדיה כדי לאסוף כל רקמה שיורית ולהעביר לצינור חרוטי לנפח כולל של 5 מ"ל. שמור את הצינורות על קרח בין שלבי העיבוד.
4. בעזרת פיפטה, יש להשהות מחדש את אבקת הקולגנאז I במצע תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) כדי להשיג את הריכוז הרצוי (כלומר, 100 מ"ג/מ"ל). הוסף סוג Collagenase I לצינור החרוטי המכיל את דגימת הרקמה הטחונה כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי (כלומר, 50 μL עבור 1 מ"ג / מ"ל).
   הערה: ריכוזים גבוהים יותר של collagenase יגדילו את תפוקת התא, אך עלולים לבקע את פני השטח של התא. לכן, יש לבצע טיטרציה של collagenase I כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי הדרוש להשגת המספר הגבוה ביותר של תאים בני קיימא עם כל הסמנים הנדרשים בפני השטח של התא ללא פגע. לדוגמה, collagenase נבדקתי בריכוזים סופיים של 0.5 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל ו-2 מ"ג/מ"ל על דגימות מוח או חוט שדרה בודדות. כדאיות התא נקבעה באמצעות שיטת ההרחקה הכחולה של טריפאן וסמני פני התא CD45, CD19 ו- CD4 הוערכו על ידי ציטומטריית זרימה. ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל של collagenase I הניב את ספירת התאים החיים הגבוהה ביותר תוך שמירה על כל הסמנים המעניינים את פני השטח של התא. לפיכך, ריכוז זה שימש לניסויים נוספים שבחנו סוגי תאים אלה.
5. יש להשהות בעדינות את אבקת DNase I באמצעות נתרן כלורי במינון 0.15M לריכוז הרצוי. הוסף את DNase I המושעה מחדש לצינור החרוטי המכיל את דגימת הרקמה הטחונה כדי לקבל ריכוז סופי של 20 U/mL.
   הערה: DNase I משתנה לפי יחידות פעילות למ"ל. הריכוז שיתווסף לדגימת הרקמה ישתנה בהתאם ליחידות הפעילות של בקבוקון המלאי למיליליטר. הריכוז הרצוי הסופי לדגימה הוא 20 U/mL.
6. הניחו את הצינורות במדף צינורות באמבט מים בטמפרטורה של 37°C ודגרו במשך 40 דקות. הפכו את הצינורות כל 15 דקות כדי לערבב היטב את הרקמה עם האנזימים. לאחר הדגירה, יש להוסיף 500 μL של 0.1 M EDTA (pH = 7.2) לכל צינור לקבלת ריכוז סופי של 0.01 M EDTA ולדגור במשך 5 דקות נוספות כדי להשבית את הקולגנאז.
7. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף 9 מ"ל של RPMI בתוספת 10% FCS לכל צינור כדי להביא את נפח כל צינור ל~ 14.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C. באמצעות פיפטה פסטר עם ואקום, שואפים supernatant, נזהר לא לגעת גלולת התא.
8. באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, הוסף 3 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות איזוטונית של 100% לצינור המכיל את גלולת התא. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף מדיה נוספת של RPMI 10% FCS כדי להביא את הנפח הסופי ל -10 מ"ל והשהה מחדש את גלולת התא כדי ליצור שכבת פתרון שיפוע צפיפות איזוטונית של 30% במלאי.
   הערה: הכינו מראש את מדיום שיפוע הצפיפות האיזוטונית של 100% במלאי, ALIQUOT ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים. כדי להכין את תמיסת שיפוע הצפיפות האיזוטונית של 100%, דלל את מדיית שיפוע הצפיפות (טבלה של חומרים) באמצעות מאגר דילול מדיה של שיפוע צפיפות. הכינו את מאגר דילול המדיה של שיפוע הצפיפות (80.0 גרם/ליטר NaCl, 3.0 גרם/ליטר KCl; 0.73 גרם/ליטר Na₂HPO₄, 0.20 גרם/ליטר KH₂PO₄; 20.0 גרם/ליטר גלוקוז) וסננו סטריליזציה באמצעות מערכת סינון ואקום. הפוך את תמיסת שיפוע הצפיפות האיזוטונית של 100% על ידי ערבוב חלק אחד של מאגר דילול שיפוע הצפיפות ומדיית שיפוע צפיפות של 9 חלקים. מערבבים היטב.
9. הפוך וערבב היטב כל צינור לפני הוספת שכבת השיפוע של שיפוע צפיפות איזוטונית של 70% מלאי. הכנס פיפטה סרולוגית 1 מ"ל המכילה 1 מ"ל של 70% תמיסת שיפוע צפיפות איזוטונית לתחתית הצינור. לאט לאט מתחת 1 מ"ל של הפתרון, נזהר לא לעשות בועות. הסר לאט את הצינור הסרולוגי מהצינור, תוך זהירות שלא להפריע לשיפוע.
   הערה: עבור השכבה התחתונה של 70%, יש לדלל את תמיסת שיפוע הצפיפות האיזוטונית של 100% מלאי ל- 70% באמצעות מדיית RPMI (כלומר, 7 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות איזוטונית של 100% מלאי ו- 3 מ"ל של מדיית RPMI מעורבבת היטב). בנוסף, יצירת שכבה תחתונה נקייה ובלתי מופרעת של 70% חיונית לסילוק פסולת מיאלין ולקבלת מתלים טהורים של תא בודד בממשק השיפוע לאחר הצנטריפוגה.
10. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C ללא בלם. שאפו את הסופרנטנט, כולל שכבת פסולת המיאלין עד שנשאר 2-3 מ"ל בצינור, תוך זהירות שלא להפריע לשכבת התא. קצרו את שכבת התא בין שיפוע הצפיפות של 30/70% באמצעות פיפטה של 1 מ"ל והעבירו לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל.
11. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף מדיה RPMI 10% FCS כדי להביא את הנפח הסופי ל -15 מ"ל. צנטריפוגה 450 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
    הערה: במהלך שלב זה, ניתן לאגד שכבות תאים משני צינורות במידת הצורך. אין לאגד יותר משני צינורות, אחרת התאים לא ייפלטו בשל ריכוז מדיה הדרגתית בצפיפות גבוהה.
12. שאפו את הסופרנאטנט בזהירות שלא להפריע לכדורית התא. השהה מחדש את התאים בנפח/מאגר מתאים כדי לספור את התאים באמצעות המוציטומטר (למשל, השהה מחדש חוט שדרה יחיד במאגר FACS של 250 מיקרוליטר עבור צביעת פני השטח במורד הזרם) (איור 1).
13. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, העבר את מתלי התאים לחלק העליון של צינור מסנן עליון (רשימת חומרים) ואפשר לתאים לסנן לתחתית הצינור כדי להסיר את שאריות המיאלין שנותרו.
14. באמצעות צבע הרחקה כחול טריפאן, לדלל אותו ולספור את התאים על hemocytometer על ידי ממוצע של לפחות שתי רשתות 16 ריבוע עבור דיוק40,41.
15. המשך בטכניקת הניתוח הרצויה של תא יחיד.
    הערה: באמצעות צורות שונות של קולגנאז (כלומר, D, סוג I, סוג II, סוג IV), תאי מערכת החיסון, מיקרוגליה (איור 1), אסטרוציטים, פריציטים, תאי אנדותל49 ונוירונים50 יכולים כולם להיות מבודדים ביעילות. ספירות תאים גרעיניים שהתקבלו עבור התוצאות היו כדלקמן באמצעות האנזים collagenase I titrated: מוח שלם שטופל בדמה = 500,000-600,000 תאים; מוח TMEV-IDD שלם = 800,000-1,000,000 תאים; חוט שדרה שלם שטופל בדמה = 150,000-200,000 תאים; חוט שדרה שלם TMEV-IDD = 300,000-400,000. ספירת התאים תשתנה בהתאם לדיוק האיסוף, העיבוד והאם קיימת דלקת במערכת העצבים המרכזית.

תוצאות

איור 1: זיהוי CD45hi החודר לתאי מערכת החיסון ברקמות מערכת העצבים המרכזית. (A) אסטרטגיית Gating לזיהוי תאי חיסון חודרים CD45hi (P1), מיקרוגליה CD45lo (P2) ו-CD45 - אוליגודנדרוציטים, אסטרוציטים ונוירונים בקרב סך התאים החיים בחוט השדרה מעכברים שטופלו בדמה (אדום) או TMEV-IDD (כחול). תאי CD45hi מינימליים זוהו במוחות ובחוטי השדרה שטופלו בדמה. (B) אסטרטגיית Gating לזיהוי תאי CD19+ B ותאי T CD4+ בקרב תאי ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלבומין בסרום בקר	תרמופישר סיינטיפיק	37002ד
צנטריפוגה	בקמן קולטר	צנטריפוגת אלגרה X-12R
קולגנאז I	וורטינגטון	LS004196
צינור חרוט, 15 מ"ל	VWR	525-1069
צינור חרוט, 50 מ"ל	VWR	89039-658
כיסוי זכוכית	האוזר סיינטיפיק	5000
מלקחיים מעוקלים	כלים מדעיים משובחים	11003-14
צינור פוליסטירן חד פעמי, 14 מ"ל	פישר סיינטיפיק	14-959-1ב
DNase I	וורטינגטון	LS002139
קרח יבש	איירגז	לא ישים
דורמונט #7Forceps	כלים מדעיים משובחים	11271-30
EDTA מלח דיסודיום דיהידראט	אמרסקו	0105-500 גרם
אתנול, 100%	כלשהו	לא ישים
צינור עליון מסנן, 5 מ"ל	VWR	352235
כתם כדאיות ניתן לתיקון 780	בקטון דיקינסון	565388
גלוקוז	פישר כימיקלים	D16-500
תמיסת המלח המנופחת של האנק (HBSS)	קורנינג	21-020-CV
המציטומטר	אנדווין סיינטיפיק	02-671-51ב
המוסטאט	כלים מדעיים משובחים	13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)	תרמופישר סיינטיפיק	15630080
KCl	פישר כימיקל	BP366-500
KH2PO4 (נטול מים)	סיגמא אולדריץ'	P5655-100G
חנקן נוזלי	איירגז	לא ישים
בלוק FC עכבר (CD16/32)	בקטון דיקינסון	553141
Na2HPO4 (נטול מים)	פישר כימיקלים	S374-500
NaCl	פישר כימיקל	S671-500
מחט, 25 מד	בקטון דיקינסון	305122
סרום עכבר רגיל	תרמופישר סיינטיפיק	31881
מסננת רשת ניילון	VWR	352350
אוקטובר	סאקורה	4583
פרפורמאלדהיד, 20%	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	15713-S	מדולל ל-4% באמצעות 1 x PBS
פיפטת פסטר, 9 אינץ', מנותקת	פישר סיינטיפיק	13-678-20ג
PBS (1x)	קורנינג	21-040-CV
PE עכבר נגד עכבר CD4	בקטון דיקינסון	553730
PE-CF594 עכבר נגד עכבר CD19	בקטון דיקינסון	562329
מדיית מעבר צבע צפיפות פרקול	GE שירותי בריאות	17-0891-01
PerCP-Cy5.5 עכבר נגד עכבר CD45	בקטון דיקינסון	550994
צלחת פטרי, 100 מ"מ	VWR	353003
מד pH	פישר סיינטיפיק	13-636-AB150
פיפט אייד	דראמונד סיינטיפיק קורפוריישן	4-000-101
פיפטה 200 μl	גילסון	FA10005M
טיפים פיפטה, 1 מ"ל	ארה"ב סיינטיפיק	1111-2831
קצוות פיפטה, 200 μl	ארה"ב סיינטיפיק	1111-1816
פיפטה, 1 מ"ל	גילסון	FA10006M
הרכבה על יהלום Prolong עם DAPI	תרמופישר סיינטיפיק	P36962
עכברוש מטוהר נגד עכבר CD16/CD32	בקטון דיקינסון	553141
ארנב נגד עכבר CD3 (שיבוט SP7)	אבקאם	dorit_16669
ארנב נגד עכבר laminin	אבקאם	ab11575
עכבר נגד עכבר ERT-R7	אבקאם	dorit_1977
RPMI 1640	קורנינג	10-040-CV
פיפט סרולוגי, 1 מ"ל	VWR	357521
פיפט סרולוגי, 10 מ"ל	VWR	357551
פיפט סרולוגי, 5 מ"ל	VWR	357543
נתרן הידרוקסידי	פישר סיינטיפיק	S318-100
סוכרוז	פישר כימיקל	S5-500
מספריים כירורגיים	כלים מדעיים משובחים	14001-16
מספריים כירורגיים, דק במיוחד	רובוז	RS-5882
מזרק, 10 מ"ל	בקטון דיקינסון	302995
מזרק, 5 מ"ל	בקטון דיקינסון	309646
כחול טריפאן	גיבקו	15250-061