טכניקה לאופטימיזציה של תרבית אורגנואידים מוחיים באמצעות הארה צידית של אור רך

תקציר

מקור: Chen, B. et al., להקל על תרבית אורגנואידים מוחית באמצעות תאורת אור רך רוחבית.J. Vis. Exp.(2022).

סרטון זה מציג את השימוש בטכניקת הארה צידית של אור רך כדי לשפר את ההדמיה בעין בלתי של גופים עובריים, ובכך להקל על מניפולציה והעברה שלהם במהלך תרבית אורגנואידים מוחיים. הוא מבהיר את ההתקנה של תאורת אור רך, שיטות לשינויי מדיה והעברת גוף עוברי, כמו גם את ההליך לגרימת התמיינות עצבית בגופי עובר להתפתחות אורגנואידים מוחיים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנת מנורת האור הרך (יום 1)

1. השתמש בלוח אקרילי שקוף בעובי של 0.3-0.5 ס"מ בגודל נייר A5. הדביקו רפידות לבנות בחלק הקדמי והאחורי של לוח האקריליק.
2. התקינו שורה של נורות LED לבנות בקצה הצלחת כך שהנורות יוכלו להיכנס מהצד של הלוח האקרילי ואז לירות החוצה במקביל (איור 1A-F, איור 2B).
   הערה: מכיוון שהקטרים של EBs בשלב המוקדם הם בערך 200 מיקרומטר עד 300 מיקרומטר, קשה לצפות בהם בבירור בעין בלתי מתחת למנורת פלורסנט של ספסלים נקיים. לעומת זאת, הודות לשיפור ההשתקפות המפוזרת, אנו יכולים לזהות את ה-EBs בבירור באמצעות אור רך מואר לרוחב (איור 2B, C). צלחת 6 בארות מומלצת לתרביות EB בניסויים הבאים. עם זאת, כדי להראות טוב יותר את האפקט החזותי של אור רך, כלים משמשים לפעמים כדי לצלם תמונות וסרטונים במחקר זה במקום צלחות, אז בבקשה לא להבין לא נכון. מנורת האור הרכה המוארת לרוחב יכולה לשמש גם לצלחת 6 בארות.

2. העברת EB והחלפה בינונית (ימים 2-5)

1. הכינו צלחת הדבקה נמוכה חדשה בעלת 6 בארות והוסיפו 2 מ"ל של מדיום היווצרות גוף עוברי (EB) לכל באר.
2. הסר את ה- EBs יחד עם המדיום עם קצה פיפטה רחב 1000 μL (ראה טבלת חומרים) והעבר אותם לצלחת הדבקה נמוכה של 6 בארות (~ 100 EBs / well).
   הערה: תהליך הפעולה מאמץ מנורת אור רכה (המוזכרת בשלב 1) כדי להקל על הצפייה ב- EBs. כבה מקורות אור פנימיים אחרים כדי לשפר את האפקט החזותי של האור הרך.
3. החלף באותו נפח של מדיום היווצרות EB טרי מדי יום. השתמש בזרימה המשנית כדי לאסוף את ה- EBs למרכז ולשנות את המדיום.
   1. שאפו את המדיום הישן על ידי פיפטינג לקצה הבאר לאט. לא למצוץ חזק מדי; אחרת, ה- EBs יוסרו יחד. לאחר מכן, הוסף מדיום טרי כדי להשעות מחדש את EBs.
      הערה: הזרימה המשנית העיקרית (איור 2D). לגרום לזרימת מערבולת על ידי סיבוב המנה לאורך מסלול מעגלי. בשל זרימת המערבולת, זרימה משנית מושרית ומכוונת לכיוון המרכז. ה- EBs או האורגנואידים מתכנסים למרכז הבאר עקב הזרימה המשנית הנוצרת באמצעות סיבוב, ולאחר מכן ניתן לבצע שינוי בינוני או החזרת עוברים בקלות.

3. אינדוקציה עצבית (ימים 5-7)

1. הכינו צלחת חדשה בעלת 6 בארות עם הדבקה נמוכה והוסיפו 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה עצבי (טבלה 1) לכל באר.
2. הפעל את האור הרך הרוחבי (המוזכר בשלב 1) וכבה מקורות אור פנימיים אחרים.
3. העבר את ה- EBs לצלחת 6 בארות עם תוספת מדיום השראה עצבי (~ 100 EBs / באר). הוסיפו כמה שפחות מהמדיום המקורי לבאר החדשה.
   הערה: הציגו מיומנויות פשוטות של העברת אורגנואידים. באופן טבעי, תחת כוח הכבידה ובצפיפות גבוהה יחסית לתווך, ה-EBs המרחפים מחדש ישקעו בהדרגה על-ידי יישום הפעולה המוצגת באיור 2E. לפיכך, EBs ניתן להעביר בנוחות. מאחר שבהשוואה ל-EBs, תאים חופשיים ומקטעי תאים מתים שוקעים לאט יותר, רוב התאים החופשיים ומקטעי התאים המתים יכולים להיות מוסרים באמצעות שיטת השיקוע הזו (איור 2F).
4. לדגור על הדגימות ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 24 h.
   הערה: תחת המיקרוסקופ, קוטר ה- EBs היה כ- 500 מיקרומטר, והקצה היה שקוף, מה שמצביע על כך שנוצרה שכבה נוירואפיתליאלית.

טבלה 1. הרכב מדיום האינדוקציה העצבית

רכיבים	נפח
DMEM-F12	97 מ"ל
תוספת N2	1 מ"ל
תוסף גלוטמקס	1 מ"ל
מם-נאה	1 מ"ל
הפארין	ריכוז סופי: 1 מיקרוגרם/מ"ל

תוצאות

איור 1: הכנת מנורת האור הרך. (A) ספק הכוח ונורות ה-LED הותקנו בצד אחד של לוח האקריליק (כפי שמוצג בתיבה האדומה המנוקדת). אורך גל הפיזור של נורת LED רכה הוא 450-470 ננומטר, שטף האור הוא 1300-1800 לומן, ואינדקס עיבוד הצבע הוא 75-85 Ra. (B) נבדק אם נורות הלד יכולות להידלק כרגיל (כפי שמוצג בתיבה האדומה המנוקדת). (C) לוח לבן הודבק על החלק הקדמי והאחורי של ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.2 מיקרומטר מסנן	NEST Biotechnology, סין	331001
1000 μL קצה פיפטה רחב	Thermo Fisher Scientific, ארה"ב	9405163
צלחת הדבקה נמוכה 6 בארות	NEST Biotechnology, סין	703011	הוא משמש לתרביות השעיה EBs
צנטריפוגה	Eppendorf, גרמניה	1850 ₪	זה יכול לשמש צנטריפוגה של סוגים שונים של צינורות צנטריפוגה, בקבוקי מגיב וצלחות עבודה.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific, ארה"ב	11330032
הפארין	Merck, גרמניה	H3149
תוסף גלוטמקס	Thermo Fisher Scientific, ארה"ב	35050061
תוסף גלוטמקס	Thermo Fisher Scientific, ארה"ב	17504044
מם-נאה	Thermo Fisher Scientific, ארה"ב	11140050
תוספת N2	Thermo Fisher Scientific, ארה"ב	17502048
מנורת אור רכה	אגוז	אגוז	מכשיר פשוט מתוצרת עצמית, עיין באיור משלים 2 להכנה.