ניתוח הפעלה מחדש של תאי גזע עצביים בצמחי מוח דרוזופילה בתרבית

תקציר

מקור: Naomi Keliinui, C., et al. הפעלה מחדש של תאי גזע עצביים בצמחי מוח דרוזופילה בתרבית. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים פרוטוקול לזיהוי גורמים אקסוגניים היוזמים הפעלה מחדש של תאי גזע עצביים במוח דרוזופילה ממצבם השקט. זחלים שזה עתה בקעו מנותחים כדי לבודד את מוחם, אשר לאחר מכן מתורבתים במדיה עם או בלי הורמון בדיקה כדי להעריך את הפוטנציאל של ההורמון לגרום להפעלה מחדש של תאי גזע עצביים והתפשטות.

פרוטוקול

1. תרבות, מדיה והכנת כלים

1. רססו את הספסל ופינת העבודה באתנול 70% והניחו לו להתייבש.
2. רססו את כלי הנתיחה, המלקחיים ושתי צלחות שעון זכוכית, באתנול 70% ותנו להם להתייבש על הספסל.
3. הכינו את המדיה המשלימה של שניידר (SSM, טבלה 1) והניחו אותה על קרח.
4. פיפטה 1 מ"ל של SSM לתוך כל אחד מכלי שעון זכוכית.
5. בעזרת מיקרופיפטה עם קצה סטרילי, מעבירים את הזחלים שזה עתה בקעו מהצלחת של PBS אל ה-SSM בצלחת שעון הזכוכית הראשונה. בעזרת מיקרופיפטה עם קצה סטרילי, מעבירים את הזחלים שזה עתה בקעו ל-SSM בצלחת שעון הזכוכית השנייה.

2. נתיחות ותרביות מוח

1. ברגע שהזחלים נמצאים בצלחת שעון הזכוכית השנייה עם SSM, נתחו את המוח מתוך הזחלים באמצעות מלקחיים ומיקרוסקופ מנתחת. התאימו את ההגדלה לפי הצורך.
2. השתמשו במלקחיים אחת כדי לתפוס את ווי הפה, ובעזרת השנייה תפסו בעדינות את הגוף באמצע הדרך למטה ומשכו בכיוון ההפוך (איור 1) כדי לפצל את הזחל לשני חלקים.
   הערה: המוח ימוקם ממש מאחורי קרסי הפה. שימו לב שייתכן שיש רקמות אחרות המקיפות את המוח. היזהר מאוד בעת הסרת רקמות אלה כפי שהוא יכול לגרום נזק למוח.
3. לאחר ניתוח 15-20 מוחות, הוסיפו 1 מ"ל של SSM לבאר אחת של מגש תרבית סטרילי בן 12 בארות. העבירו את המוחות שזה עתה נותחו לתוך ה-SSM באמצעות מיקרופיפטה וקצה סטרילי (איור 2A).
4. מקמו את המוחות במדיה SSM במגש התרבית של 12 בארות לתוך אינקובטור בטמפרטורה של 25°C למשך 24 שעות (איור 2A).

טבלה 1: מתכון להכנת תוספת מדיה של שניידר (SSM). הטבלה מפרטת את נפח כל המרכיבים הדרושים להכנת 5 מ"ל של SSM.

מרכיב (ריכוז התחלתי)	כדי להפוך 5 מ"ל	ריכוז סופי
מדיה דרוזופילה של שניידר	3.89 מ"ל
סרום בקר עוברי (100%)	500 μL<	10%
גלוטמין (200 מילימול)	500 μL	20 מ"מ
פניצילין (5,000 יחידות/מ"ל), סטרפטומיצין (50,000 מיקרוגרם/מ"ל)	100 מיקרוליטר	1000 U/מ"ל עט, 1 מ"ג/מ"ל Strep
אינסולין (10 מ"ג/מ"ל)	10 מיקרוליטר	0.02 מ"ג/מ"ל
גלוטתיון (50 מ"ג/מ"ל)	5 מיקרוליטר	0.05 מ"ג/מ"ל
במכסה מנוע סטרילי, בטכניקה סטרילית, מוסיפים את כל המרכיבים יחד בצינור חרוטי של 14 מ"ל. מניחים אותו על קרח עד לשימוש.

תוצאות

איור 1: זחלי דרוזופילה בצלחת שעון זכוכית עם SSM. המלקחיים ממוקמים כראוי לנתיחה. מיקום מוח הזחל (אפור כהה) הוא אחורי לקרסי הפה (שחור), ושניהם מוצגים בתוך הזחל.

תרשים 2: תרבית מוח ו immunostaining. (A) מוח שלם בצלחת תרבית של 12 בארות המכילה 1 מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10 μL טיפים פיפטה	דנוויל Sci	P2102
1000 μL טיפים פיפטה	דנוויל Sci	P2103-N
1000 מיקרוליטר פיפטור	גילסון	P1000
צלחות תרבות מרובות בארות 24 בארות	פישר סיינטיפיק	50-197-4477
צלחות פטרי 35 מ"מ	פישר סיינטיפיק	08-757-100A	מרכיבי צלחת ענבים
מיקרוסקופ מנתח	זיס	סטמי 2000
אתנול 200 הוכחה (100%), Decon Labs, בקבוק 1 גלון	פישר סיינטיפיק	2701	משמש לשטיפת הזחלים לפני אחיזת 24 השעות במדיום התרבית
סרום בקר עוברי (10%)	סיגמא	F4135-100ML	תוספת מדיה לתרבית תאים.
מלקחיים עדינים לדיסקציה	כלים מדעיים משובחים	11295-20	מלקחיים המשמשים בדיסקציות. הם פועלים בצורה הטובה ביותר כאשר הם מושחזים.
צלחת דיסקציה זכוכית (3 באר)	אלה אינם זמינים עוד
גלוטתיון	סיגמא	G6013	מספק הגנה חמצונית במהלך תרבית תאים.
אינקובטור	תרמו פישר סיינטיפיק		מבטיח שהטמפרטורה, הלחות והחשיפה לאור יהיו זהות לחלוטין במהלך הניסוי.
אינסולין	סיגמא	I0516	משתנה בלתי תלוי של הניסוי
מכסה מנוע זרימה למינרי			על ציטוט אמצעי התקשורת התרבותיים
ל-גלוטמין	סיגמא	G7513	מספק תמיכה במהלך תרבית תאים
Pen-Strep	סיגמא	P4458-100 מ"ל	תרופות אנטי-ביודיות המשמשות למניעת זיהום חיידקי של תאים במהלך התרבית.
מאגר פוספטים, pH7.4	תוצרת בית	תוצרת בית	ממס המשמש לשטיפת המוח לאחר שלבי תיקון והכתמה
לבחור	כלים מדעיים משובחים	10140-01	משמש לקטיף זחלים מצלחת הענבים
מדיום התרבות של שניידר	לייף טק	21720024	מכיל חומרים מזינים המסייעים לתאים לגדול ולהתרבות
מים סטריליים	Autoclave Milli-Q מים תוצרת בית		דרושים לפתרונות