$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. דיסוציאציה של קליפת המוח של העכבר
- הקריבו גורי עכברים C57Bl/6N בני 5-7 ימים לאחר הלידה על ידי עריפת ראש מהירה עם מספריים שנוקו בעבר באתנול 70%.
הערה: קליפות המוח של 5-6 גורי עכברים ילודים שימשו לכל תכשיר. בממוצע, מוח עכבר אחד מניב 1-1.5 x 106 אוליגודנדרוציטים ראשוניים (Ols).
- חותכים את עור הקרקפת לאורך קו האמצע בעזרת מספריים קטנים ומנתחים כדי לחשוף את הגולגולת.
- חתכו את הגולגולת בזהירות לאורך קו האמצע החל מהפתח בחלק האחורי של הגולגולת לכיוון האזור הקדמי, הרימו עם המספריים כדי למנוע פגיעה במוח. לאחר מכן, באמצעות הפתח בחלק האחורי של הגולגולת לחתוך לכיוון כל ארובת העין לאורך בסיס הגולגולת.
- השתמש במלקחיים עדינים כדי להקניט בעדינות את קליפות המוח התיכון ולהעביר אותם לצלחת תרבית רקמה 60 מ"מ המכילה 7 מ"ל של B27NBMA. חזרו על שלבים 2.2 עד 2.4 עבור כל מוח, תוך איגום קליפות המוח המנותחות.
- העבירו את קליפת המוח לצלחת תרבית רקמה חדשה בקוטר 60 מ"מ המכילה 5 מ"ל של חיץ דיסוציאציה (B27NBMA, 20-30 U/mL פפאין ו-2,500 U DNase I).
- חתכו את קליפות המוח לחתיכות קטנות של כ-1 מ"מ3 באמצעות להב אזמל #15 ודגרו במשך 20 דקות באינקובטור של 37°C, 5% פחמן דו-חמצני (CO2).
- הוסף 1 מ"ל של סרום גידול בקר (BGS) כדי לעצור את התגובה האנזימטית.
- מעבירים את קליפת המוח יחד עם אמצעי הדיסוציאציה לצינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות פיפט סרולוגי של 10 מ"ל.
- בעדינות להתחיל לנתק את רקמת המוח על ידי pipeting איטי למעלה ולמטה 6-8 פעמים באמצעות pipet סרולוגי 10 מ"ל, תוך שימוש בזהירות כדי למזער בועות.
- מניחים לגושי הרקמה להסתפק במשך 2-3 דקות ומעבירים את הסופרנאטנט לצינור טרי.
- הוסף 3 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% BGS/2500 U DNase I לגלולת הרקמה.
- השתמש פיפטה סרולוגית 5 מ"ל כדי לנתק בעדינות את רקמת המוח תוך כדי pipeting למעלה ולמטה 6-8 פעמים. היזהר למזער בועות.
- הניחו לגושי הרקמה להסתפק במשך 2-3 דקות.
- מעבירים את הסופרנאטנט לצינור טרי. הוסף 3 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% BGS/DNase I לגלולת הרקמה.
- נתקו בעדינות את רקמת המוח באמצעות קצה צינור P1000, תוך שאתם מעלים ומורידים את תערובת המדיה ורקמת המוח. חזור על שלבים 2.13 ו- 2.14 עד שלא יישארו גושים גדולים של רקמה או עד שתמוצה B27NBMA המכילה 10% BGS/DNase I, המוקדם מביניהם. היזהר למזער בועות.
- מתלה תאי בריכה עם סופרנאטים קודמים.
- מניחים מסננת תאים של 70 מיקרומטר בצינור של 50 מ"ל. בעזרת פיפט סרולוגי של 10 מ"ל, העבירו את תרחיף התאים המאוחד בעדינות מעל מסננת התאים בגודל 70 מיקרומטר.
- שטפו את מסננת התאים על ידי הוספת 1 מ"ל B27NBMA המכיל 10% BGS/DNase I.
- השליכו את מסננת התא. הביאו את הנפח ל-30 מ"ל עם B27NBMA המכיל 10% BGS/DNase I.
- מעבירים את מתלה התא לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל. צנטריפוגה את מתלה התא למשך 10 דקות ב 200 x גרם.
- הסר את supernatant מבלי להשאיר את התאים חשופים לאוויר. הסופרנאטנט יהיה מעונן עקב פסולת תאים. הוסף 3 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% BGS לכדור.
- נתק בזהירות את גלולת התא באמצעות פיפט P1000. הביאו את הנפח ל -15 מ"ל עם B27NBMA המכיל 10% BGS.
- מעבירים את מתלה התא מעל מסננת תאים טרייה של 40 מיקרומטר.
- שטפו את מסננת התאים על ידי הוספת 1 מ"ל B27NBMA המכיל 10% BGS. השליכו את מסננת התא.
- הביאו את הנפח ל-30 מ"ל עם B27NBMA המכיל 10% BGS.
- העבר את מתלה התא ל 2 x 15-mL צינורות חרוטיים. צנטריפוגה את מתלה התא למשך 10 דקות ב 200 x גרם.
- מוציאים את רוב הסופרנאטנט מבלי להשאיר את התאים חשופים לאוויר. השהה מחדש את כדורי התא ב-5 מ"ל של מאגר מיון תאים מגנטיים קרים כקרח (MCS).
2. קביעת ספירת תאים וכדאיות
- יש לדלל 100 μL של תרחיף התא עם 400 μL של Trypan Blue Solution בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל כדי להשיג דילול של 1:5 ב-0.4% (w/v).
- מרכזים את זכוכית הכיסוי מעל תא ההמוציטומטר וממלאים את שני התאים ב-10 מיקרוליטר של דילול התא באמצעות פיפטה P10 והימנעות ממילוי יתר. הפתרון יעבור מתחת לזכוכית הכיסוי על ידי פעולה נימית.
- הניחו את ההמוציטומטר על במת המיקרוסקופ והתאימו את המיקוד באמצעות הגדלה פי 40.
הערה: ספירת תאים נרשמת באמצעות מונה ידני בכל אחד מחמישה ריבועים (ארבע פינות ומרכז אחד). רק תאים שאינם בני קיימא סופגים את הצבע ונראים כחולים, בעוד תאים חיים ובריאים נראים עגולים ושבירה ואינם סופגים את הצבע הכחול, מה שמאפשר לקבוע את מספר התאים הקיימים והכוללים למיליליטר.
3. בידוד של אוליגודנדרוציטים O4+
- צנטריפוגה את מתלה התא ב 200 x גרם במשך 10 דקות.
- בזהירות להשליך את supernatant באמצעות שאיפת ואקום, הימנעות חשיפה של התאים לאוויר.
- השהה מחדש את הגלולה ב 90 μL של מאגר MCS לכל 1 x 107 תאים סה"כ ולאחר מכן תוספת של 10 μL של חרוזים נגד O4 לכל 1 x 107 תאים.
- מערבבים את מתלה התא והחרוזים על ידי תנועה עדינה של הצינור החרוטי 15 מ"ל עם האצבע 4-5 פעמים.
- לדגור על התערובת במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, להעיף את הצינור החרוטי 15 מ"ל עם האצבע 4-5 פעמים כל 5 דקות.
- שטפו את התערובת על ידי הוספה עדינה של 2 מ"ל של חיץ MCS לכל 1 x 107 תאים לצינור. צנטריפוגה את התערובת ב 200 x גרם במשך 10 דקות.
- השליכו את הסופרנאטנט על ידי שימוש זהיר בשאיפת ואקום, תוך הימנעות מחשיפת התאים לאוויר. להשהות מחדש את גלולת התא ב 500 μL של מאגר MCS עבור כל 1 x 107 תאים.
- חברו מפריד מגנטי למעמד מפריד מגנטי. חברו עמודת בחירה למפריד המגנטי והניחו מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר על גבי העמודה. הניחו שני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל או צינור חרוטי אחד של 50 מ"ל מתחת לעמוד ההפרדה כדי לאסוף את הזרימה דרכה.
- שטפו מראש את המסננת ועמוד ההפרדה של התאים בגודל 40 מיקרומטר עם 3 מ"ל של מאגר MCS ותנו למאגר לעבור דרך העמוד מבלי לתת לו להתייבש.
- הוסף את תערובת מתלי התאים והחרוזים למסננת התאים ולעמודת הבחירה.
- שטפו את מסננת התאים בגודל 40 מיקרומטר עם 1 מ"ל של מאגר MCS.
- השליכו את מסננת התאים ותנו לתערובת התאים, החרוזים והמאגר לעבור דרך העמוד מבלי לתת לו להתייבש.
- שטוף את עמודת ההפרדה 3 פעמים עם 3 מ"ל של מאגר MCS ופעם אחת עם מדיית התפשטות OL.
- הסר את עמוד ההפרדה מהמפריד המגנטי, מקם אותו במהירות בצינור חרוטי של 15 מ"ל והוסף מיד 5 מ"ל של מדיית התפשטות OL.
- הניחו בוכנה על גבי העמוד ודחפו בחוזקה כדי לשטוף את התאים המסומנים לתוך הצינור החרוטי של 15 מ"ל.
- הסר 100 μL של תרחיף תאים כדי לקבוע את ספירת התאים ואת הכדאיות באמצעות Trypan Blue ו hemocytometer כמצוין בסעיף 3.
הערה: כדאיות תאים מעל 80% נחשבת מקובלת להמשיך עם תרבית OLs, אך כדאיות גדולה מ- 90% היא אופטימלית.